颗粒酶M在肿瘤中的表达和功能的相关研究

发布时间：2019-08-05 09:28

【摘要】：随着现代医学科学的飞速进步,在仅数十年中肿瘤学家在跟肿瘤的斗争中取得了巨大的进展,但肿瘤的耐药、侵袭和转移以及复发仍然是阻碍临床治疗的巨大的挑战。本实验室前期的研究发现经过化疗药物5-氟尿嘧啶处理后存活的慢周期CT26细胞具有化疗耐药、成瘤性更强等特点,可能成为复发和转移的源头。为了探寻其中的机制,我们通过表达谱芯片发现了一些表达显著改变的基因和信号通路。在本研究中我们聚焦其中一个比较特别的基因：颗粒酶M,着重探索其在肿瘤细胞中的表达和意义。颗粒酶M (granzyme M, GZMM),之前认为其限制性表达在NK细胞等淋巴细胞中,与穿孔素等联合作用通过蛋白裂解导致细胞凋亡。近年来对颗粒酶的研究越来越深入,最近的证据显示颗粒酶的功能非常多样,从降解细胞外基质到促进细胞因子产生,生长因子释放,和直接抗病毒效应等等。在本研究中,我们根据表达谱芯片中的数据第一次验证了GZMM在一系列小鼠和人肿瘤细胞系中不同水平的表达,而且在人的结肠癌、乳腺癌和肺腺癌样本中检测到表达。GZMM在结肠癌的表达显著高于配对的癌旁的粘膜组织,在发生转移的原发结肠癌中的表达平均高于未发生转移的肿瘤,提示其表达与转移的联系。GZMM在经过化疗药物5-FU处理后的慢周期CT26和4T1细胞中表达上升。利用慢病毒转染在体外构建敲降GZMM和过表达GZMM的细胞系并证实。敲降和过表达GZMM对肿瘤细胞的体外增殖没有显著影响,但敲降GZMM可显著降低细胞的克隆增殖能力,过表达GZMM能显著增强细胞的克隆增殖能力,体现了GZMM在苛刻的条件下能够促进细胞的增殖能力。药物敏感试验显示敲降GZMM的CT26和LLC对化疗药物的杀伤耐受性显著降低,过表达GZMM的可增强CT26和4T1对化疗药物杀伤的耐受能力。Transwell侵袭能力检测结果显示敲降GZMM的CT26细胞与对照细胞相比体外侵袭能力显著降低,而过表达GZMM的4T1细胞的侵袭能力则显著提高,提示GZMM可增强细胞的侵袭能力。细胞因子检测显示敲降GZMM的CT26细胞与对照细胞相比分泌炎症因子IL-6和促血管生成的VEGF显著减少,而过表达GZMM的4T1细胞则能分泌更多的IL-6和VEGF。小鼠体内皮下成瘤实验显示敲降GZMM的CT26和LLC在小鼠体内的肿瘤与对照相比生长显著受抑制,而过表达GZMM的CT26则能生成比对照更大的肿瘤,4T1中过表达GZMM能促进肿瘤在体内的转移,显著降低小鼠的生存期,提示了GZMM具有在体内促进肿瘤的生长和转移的能力。机制探索显示5-FU处理后的CT26和4T1细胞经历了不同程度的上皮间质转化,CT26-sh GZMM与CT26-NC相比显示出间质表型更少,4T1-GZMM比4T1-NC上皮标志表达下降,间质表型表达上升,提示GZMM与上皮间质转化之间密切的联系。另外检测信号通路活化情况发现抑制GZMM的表达能抑制STAT3的磷酸化状态,过表达GZMM能促进STAT3磷酸化,而AKT和ERK的磷酸化水平没有显著改变,提示GZMM的表达可能与STAT3的活化相关。综上所述,我们的研究证实了GZMM在肿瘤细胞中的表达,在肿瘤细胞的增殖、耐药、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用,同时与上皮间质转化和STAT3的活化密切相关,扩展了GZMM的生物学意义,为肿瘤的临床治疗提供新的思路。
【图文】：

颗粒酶M在肿瘤中的表达和功能的相关研究

时也检测了邋ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ的表达情况。结果与在小鼠肿瘤中检测到的情况类逡逑似，ＧＺＭＭ在这几种人的肿瘤细施中都具有民ＮＡ的表达，，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己细胞中表达（图５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表达，我们采用胞内染逡逑色，流式细胞仪检测其在人肿瘤细胞中的表达。结果如图６显示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分细胞中呈现阳性表达，在ＰＣ－３中基本无阳性细胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高转移亚系，这个结果提示我们ＧＺＭＭ在肿瘤细胞中逡逑的表达可能与肿瘤的转移性相关。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ逦１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ逦R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目逦１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逦２１８ｂｐ逡逑图５人肿瘤细胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表达情况逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人肿瘤细胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和结肠癌ＨＴ－２９）中的表达情况。人的外周血淋己细胞ＰＢＭＣ逡逑作为阳巧对照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作为内参。逡逑５０逡逑

颗粒酶M在肿瘤中的表达和功能的相关研究

ＧＺＭＭ在这几种人的肿瘤细施中都具有民ＮＡ的表达，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己细胞中表达（图５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表达，我们采用胞内染逡逑色，流式细胞仪检测其在人肿瘤细胞中的表达。结果如图６显示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分细胞中呈现阳性表达，在ＰＣ－３中基本无阳性细胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高转移亚系，这个结果提示我们ＧＺＭＭ在肿瘤细胞中逡逑的表达可能与肿瘤的转移性相关。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ逦１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ逦R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目逦１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逦２１８ｂｐ逡逑图５人肿瘤细胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表达情况逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人肿瘤细胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和结肠癌ＨＴ－２９）中的表达情况。人的外周血淋己细胞ＰＢＭＣ逡逑作为阳巧对照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作为内参。逡逑５０逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

【参考文献】