miR-337及细胞自噬相关基因LC3B、p62、p53在人视网膜母细胞瘤中的功能和意义

发布时间：2019-08-15 07:00

【摘要】：目前越来越多的报道揭示了细胞自噬在细胞生理过程中的重要作用和意义,细胞自噬的异常以及功能性障碍往往与人的各种恶性肿瘤的发生发展以及恶性行为密切相关。然而目前为止,关于细胞自噬在人的各种恶性肿瘤中发挥作用的细胞和分子机制人们还不是十分明确,更进一步的研究十分需要而且非常有意义,在各类肿瘤中,细胞自噬在视网膜母细胞瘤中的作用更是知之甚少。目前为止,科学家的研究显示,人体细胞自噬是机体正常机能的体现,异常的细胞自噬状况往往与人体机能紊乱、疾病的高发有关,已有证据显示人体神经系统的异常、人体细胞老化和人体老龄化速度加快、癌症的发生都与异常的细胞自噬相联系。在人体癌症的发生中细胞自噬究竟扮演何种角色,人们广泛关注和研究,然而由于其作用机制复杂,在整个癌症的起始、发生、发展、恶性变异过程中细胞自噬发挥的功能不尽相同,因此该课题引发科学界的争论和探讨。细胞自噬促进机体细胞对于恶劣环境的适应,对于癌细胞,细胞自噬的这一基本功能同样适用,因此从一定程度上来讲,细胞自噬具有促进癌适应、生长的作用。面对正常机体对于癌细胞的排斥以及治疗过程中药物等制造的恶劣环境,细胞自噬帮助癌细胞生存和适应。然而对于癌细胞的起始过程,由于细胞自噬帮助机体正常细胞清理废旧物质加以循环利用,减少了致癌物质的堆积,帮助机体维持酸碱平衡等,因此从这个角度来看细胞自噬对于癌细胞的起始有抑制作用。在人体大部分种类的癌症中,细胞自噬都发挥着重要作用,这从各种癌症中细胞自噬相关蛋白的异常和介导的功能可以找到答案。Beclin-1,LC3B,p62等就是研究的比较多的细胞自噬基因,Beclin-1在许多种类的人体癌症中发挥着抑癌作用,而LC3B,p62在许多种类的人体癌症中发挥着促癌作用。在本课题中,我们收集了视网膜母细胞瘤病人经福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤组织,通过组织切片利用免疫组织化学实验方法检测了细胞自噬标志性蛋白LC3(微管相关蛋白轻链3B)和p62(SQSTM1),进一步进行各种临床病理学特征与这两种蛋白表达量的组合相关分析,研究细胞自噬行为在人视网膜母细胞瘤中的作用。更进一步,我们分析了在人视网膜母细胞瘤组织中LC3B和p62彼此之间的内在联系,以及它们与p53蛋白之间的相关性,p53蛋白是近些年新发现的能够抑制细胞自噬作用的蛋白。在细胞自噬的研究中,lc3b往往用来衡量lc3蛋白的表达,而lc3蛋白是目前被普遍接受的细胞自噬标记蛋白。同时p62也是经常用来检测细胞自噬过程的标记蛋白,p62蛋白在细胞自噬过程中主要在降解代谢废物中发挥具体功能。在细胞自噬过程中,lc3与p62蛋白分别在上下游过程中发挥具体功能,它们的联合检测也成为评价细胞自噬活性的一个指标。针对该二者的检测,通过蛋白质免疫印迹实验可以检测不同细胞中它们的表达水平差异,表达水平高代表着细胞自噬活性高,反之代表细胞自噬活性低;利用免疫荧光实验可以将这两个蛋白表达阳性的细胞用荧光标记出来,通过在荧光显微镜下可以直观检测到该两种蛋白阳性的细胞,也就是代表了发生细胞自噬的细胞;近来,免疫组织化学技术在组织切片中检测这两个蛋白的表达也成为一种重要的方法,而且该技术也不断完善,而且可以与组织病理学和形态学相联系。在正常人体细胞中,p53基因参与了染色质的损伤修复、细胞分裂周期、细胞程序性死亡等过程,对于维持细胞正常的细胞周期十分重要,作为一个调节基因转录过程的功能性基因,p53已经被证明并被普遍认可是一个重要的肿瘤抑制基因。对于细胞自噬,有报道显示p53基因也发挥了一定功能,而在细胞自噬过程中发挥作用的p53主要是细胞质p53蛋白。同时为了探讨p53调节细胞自噬的上游调控机制,本研究进一步通过生物学预测加实验验证的方法,筛选了调节p53乃至自噬的靶向mirna。我们的实验结果充分证明lc3b和p62蛋白的表达水平与人视网膜母细胞瘤的发生发展以及恶性侵袭具有显著正相关性。而且我们证实了p53蛋白在细胞质中的表达水平与恶性视网膜母细胞瘤的侵袭能力具有显著负相关性。p53蛋白在细胞质中的表达水平与lc3b和p62蛋白二者之间的表达水平具有显著负相关特征,这是通过spearman相关性分析得到的。体外研究发现,p53可以下调lc3b和p62表达,进而抑制人视网膜母细胞瘤的自噬进程;并且,生物学预测结合实验验证显示p53是mir-337的靶基因,mir-337通过下调细胞p53表达促进人视网膜母细胞瘤的自噬进程。因此,我们可以得出结论,细胞自噬在人的视网膜母细胞瘤中发挥着重要作用,它能够促进视网膜母细胞瘤的发生发展和恶性行为,在此过程中lc3b和p62的表达水平可以作为疾病发展预测和诊断的指标。此外我们证明了在人视网膜母细胞瘤细胞中p53能够抑制atg5,atg7,atg12,beclin1,lc3,p62等基因的表达,从而发挥抑制细胞自噬的功能。miR-337能够靶向抑制调节p53基因,在人视网膜母细胞瘤细胞中发挥促进细胞自噬功能。
【图文】：

溶解曲线,荧光,联管,引物

图2.1 SYBR Green 法荧光实时定量 PCR准备荧光实时定量 PCR 反应专用的 PCR 管（八联管），按照每检测一个样本的一个基因 3 个重复孔进行标记好。配制反应混合物，大概包括 ROX 染色剂，SYBR Green 反应酶，待检测基因的正反向引物，模板 RT 产物（cDNA），用双蒸水稀释按照试剂说明书配制每孔20 微升系统的反应液。利用荧光实时定量 PCR 仪进行反应，一般选择 40 循环，利用溶解曲线判断 PCR 反应的特异性程度。利用统计软件进行分析。所用引物如下：Name Sequence5'-3'GAPDH sense 5'- TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'antisense 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'ATG5 sense 5'-AGAATAGCCAGTACAGCA-3'

组织固定,固定剂,固定液,第三

安徽医科大学博士学位论文片的组织块大小不能太大，一般大小不能超过 2 厘米，，厚度不能超过 4本制作第二步是固定，组织固定要选取合适的固定液，一般选择 10%甲为组织标本的固定液，固定时间要恰到好处，一般固定 3-12 小时，时间固定不充分，时间太长固定液福尔马林会产生福尔马林色素，对后续免学染色造成干扰，而且固定时间太长还会降低组织的抗原的活性，对免学中抗原抗体的特异性反应造成影响。（甲醛溶液：中国国药集团试剂
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.7

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