抗糖尿病药物中激活Nrf2通路的抗氧化剂对肿瘤转移的影响及机制研究

发布时间：2019-08-15 07:42

【摘要】：【背景及目的】流行病学调查显示,糖尿病患者中某些肿瘤发生率增高,2010年美国糖尿病协会和美国癌症协会的共识报告显示2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者罹患结肠直肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌等的风险增加;且其相关性在近期发表于British Medical Journal的meta分析中得到了证实。随着糖尿病患病率的增加,糖尿病合并肿瘤患者群也日益增多。对于糖尿病合并肿瘤这一特殊人群也需采取相应的降糖措施,但降糖治疗对肿瘤生物学行为影响的具体机制尚不明确。二肽基肽酶IV抑制剂(DPP-4i)是临床常用的降糖药物,且被美国临床内分泌学会(AACE)糖尿病综合管理指南推荐DPP-4i作为二甲双胍之外的一线药物选择。我们前期的meta分析提示,DPP-4i并不增加新生肿瘤发生风险,故其对单纯的糖尿病患者是适用的;其在糖尿病合并肿瘤患者中的应用是否安全及其具体的影响机制尚需进一步研究证实。α-硫辛酸(alpha lipoic acid,ALA)由于其能够增加内源性抗氧化剂及Ⅱ相解毒酶的水平,具有保护细胞免受氧化应激损伤的作用。因此ALA常被作为抗氧化剂用于预防糖尿病、高血压等疾病对机体的氧化应激损伤;同时也被推荐作为抗肿瘤药物。ALA的抗肿瘤作用主要表现为抑制肿瘤细胞增殖,促进其凋亡;而对于肿瘤转移的影响目前尚未得到研究者们的太多关注。本研究拟通过离体肿瘤模型观察DPP-4i、ALA对肿瘤细胞迁移、侵袭行为的影响;通过建立肝癌、结肠癌转移模型裸小鼠,观察DPP-4i、ALA对体内肿瘤转移的影响。并利用离体及在体肿瘤模型,结合基因沉默或过表达/药理激活Nrf2等技术,阐明DPP-4i、ALA促肿瘤转移的可能分子生物学机制。旨在明确DPP-4i与肿瘤生物学行为关联,解析其可能的分子信号级联机制,探索糖尿病合并肿瘤的合理用药原则。【方法】1.离体实验1.1 DPP-4i对肿瘤细胞的效应观察:沙格列汀(Saxagliptin,0.1μM)、西格列汀(sitagliptin,0.6μm)处理肿瘤细胞;(1)transwell、transwell+基质胶实验检测细胞迁移、侵袭能力;(2)活细胞工作站系统观察细胞的定向迁移性,采用imagej分析细胞的定向性(persistence)及迁移指数(forwardmigrateindex,fmi)。1.2dpp-4i对dpp-4酶活性、氧化应激及nrf2途径的影响:(1)elisa试剂盒检测dpp-4酶活性变化;(2)氧化应激检测:dcfh-da探针ros检测;gsh/gssg检测:参照试剂盒说明书进行(gshandgssgassaykit,碧云天),酶标仪a412测吸光度;8-oxo-dg检测:细胞预处理后多聚甲醛固定,荧光间接染色法标记8-oxo-dg(abcam);(3)nrf2与Ⅱ相解毒酶表达检测:qrt-pcr检测基因转录、免疫组化、westernblot检测蛋白表达;(4)泛素化实验分析keap1-c151s对sax诱导nrf2激活的影响。1.3westernblot检测肿瘤转移相关蛋白表达,包括:(1)转移相关蛋白:hif-1、vegf、cox-2;(2)淋巴转移(结肠癌)相关蛋白:april、babmi;(3)血行转移(肝癌)相关蛋白:cortactin。1.4基因沉默、过表达/药理(ala、莱菔硫烷(sulforaphane,sf))激活nrf2对肿瘤细胞相关表型的影响:(1)transwell、transwell+基质胶实验检测细胞迁移、侵袭能力;(2)活细胞工作站系统观察细胞的定向迁移性,分析细胞的定向性(persistence)及迁移指数(fmi)。1.5基因沉默、过表达/药理(ala、sf)激活nrf2对肿瘤转移相关蛋白表达的影响:免疫组化、westernblot检测相关蛋白表达,包括:hif-1、vegf、cox-2april、babmi、cortactin等。2.在体实验2.1dpp-4i对肿瘤转移作用的体内研究:(1)雌性balb/c-nu/nu裸小鼠8周时,分别通过尾静脉、爪垫注射huh-7-luc+、hct116-luc+细胞建立肝癌、结肠癌转移模型。两类模型均分为对照组、沙格列汀组(15mg/kg)、西格列汀组(120mg/kg),三组分别以灌胃的方式、每日1次给予安慰剂、沙格列汀、西格列汀0.2ml,干预6周。(2)小动物活体成像观察体内肿瘤形成及转移情况;(3)he染色观察肝脏、肺等器官肿瘤转移的组织形态学变化;(4)免疫组化、westernblot检测肝、肺等组织nrf2及其下游相关基因、肿瘤转移相关蛋白表达。2.2基因沉默nrf2对肿瘤转移作用的体内研究:雌性balb/c-nu/nu裸小鼠8周时,尾静脉注射huh-7-luc+细胞建立肝癌转移模型。(1)随机分为对照组、nrf2shrna组,喂养3周,小动物活体成像观察体内肿瘤转移情况;(2)对照组、nrf2shrna组内分别再分为sax组(sax15mg/kg)、sit组(sit120mg/kg),药物以灌胃的方式给予(药物体积:0.2ml),干预3周。观察指标同2.1。2.3ala、sf对肿瘤转移作用的体内研究:雌性balb/c-nu/nu裸小鼠8周时,尾静脉注射huh-7-luc+细胞建立肝癌转移模型。随机分为对照组、ala组(80mg/kg)或对照组、sf组(10mg/kg),均以腹腔注射的方式给药(药物体积均为:0.2ml),干预3周。观察指标同2.1。3.人肝癌组织芯片免疫组化染色:对195例肝癌组织芯片(105例未转移肝癌、69例发生淋巴转移肝癌、2例发生远处转移肝癌、19例肝癌转移病灶)免疫组化染色结果进行评分,分析nrf2、gclm的蛋白表达情况。【结果】1.1dpp-4i对肿瘤细胞的效应观察:(1)transwell、transwell+基质胶实验、活细胞工作站的结果提示sax、sit作用的肿瘤细胞的迁移、侵袭能力增加,且肿瘤细胞的定向迁移能力显著增加(persistence提高、fmi增加)。(2)westernblot分析,sax、sit干预后肿瘤细胞的转移相关蛋白表达增加。1.2小动物活体成像结果显示:sax、sit干预6周的肝癌、结肠癌肿瘤转移模型裸小鼠体内肿瘤转移明显增加;体重明显减低;免疫组化及westernblot结果显示:dpp-4i干预的肝脏、肺组织中转移相关蛋白的表达水平升高。1.3氧化应激检测结果表明:dpp-4i显著降低肿瘤细胞内的ros、8-oxo-dg水平,增加gsh/gssg比例,提示:dpp-4i促肿瘤转移可能与氧化应激水平降低有关。1.4dpp-4i干预的肿瘤细胞及肿瘤模型肝脏、肺组织的nrf2及其下游相关基因的蛋白表达水平显著增加,提示:dpp-4i促肿瘤转移可能与nrf2上调有关;泛素化实验结果提示,dpp-4i对nrf2的激活可能与其抑制keap1-c151s对nrf2的降解实现的。1.5基因沉默nrf2能够显著改善自发及dpp-4i诱导的肿瘤细胞及肝癌转移模型裸小鼠体内肿瘤的转移。1.6过表达/药理(ala、sf)激活nrf2,肿瘤细胞及肝癌转移模型裸小鼠体内肿瘤转移显著增加。1.7对195例人肝癌组织芯片免疫组化染色结果进行分析,发现nrf2、gclm的蛋白表达与肿瘤的转移、分期密切相关。【结论】我们的研究结果表明,治疗糖尿病药物dpp-4i和ala能够通过抑制肿瘤中的keap1-c151s泛素化进而激活nrf2,从而促进肿瘤的迁移与侵袭。而且,人组织芯片结果分析表明Nrf2的蛋白表达水平与肿瘤的转移密切相关,提示其可作为潜在的肿瘤生物进展标志物及分子治疗靶点。我们的研究结果进一步提示,激活Nrf2的抗氧化剂在肿瘤患者中的运用应当慎重。
【图文】：

图 2.2.1 Sax、Sit 对肿瘤细胞 DPP-4 酶活性的影响影响肿瘤细胞增殖，（A）SW480、HCT116、HuH-7 分别细胞经 0.CCK-8 检测试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况。结果响无统计学意义。（B）SW480、HCT116、HuH-7latin（Cis），或 Sax 与 Cis 同时处理 96 小时，经情况。结果表明，与 Cis 单药处理组相比较，同 Cis 的敏感性。

图 2.2.1 Sax、Sit 对肿瘤细胞 DPP-4 酶活性的影响2.2.2 DPP-4i 不影响肿瘤细胞增殖如图 2.2.2 所示，（A）SW480、HCT116、HuH-7 分别细胞经 0.1μM Sax、0.6μM Si处理 72 小时，，经 CCK-8 检测试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况。结果表明， DPP-4i 对肿瘤细胞增殖的影响无统计学意义。（B）SW480、HCT116、HuH-7 分别细胞经 0.1 μMSax、16.7 μM cisplatin（Cis），或 Sax 与 Cis 同时处理 96 小时，经 CCK-8 检测试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况。结果表明，与 Cis 单药处理组相比较，同时运用 Sax 处理并不影响肿瘤细胞对 Cis 的敏感性。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R730.5

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王新军,周正炎;抑制肿瘤转移的研究进展[J];口腔颌面外科杂志;2002年01期

2 ;2007全国肿瘤转移学术大会第一轮通知[J];中国肺癌杂志;2007年04期

3 过邦辅;恶性肿瘤与肿瘤转移　第3讲　肿瘤转移治疗的新概念[J];中国肿瘤;1999年03期

4 孙青,江培洲,沈新明,姚开泰;肿瘤转移的分子机制及其调控因素研究进展[J];国外医学(肿瘤学分册);2000年04期

5 杨威,李凡,李胜文;抗肿瘤转移治疗的研究新进展[J];国外医学.泌尿系统分册;2000年03期

6 卢大用,曹静懿;肿瘤转移的实验病理学研究[J];河南医学研究;2000年03期

7 张润玲;肿瘤转移的分子机制[J];兰州医学院学报;2000年02期

8 王涛,陆应麟,刘爽,谢庆军;抑制消减杂交技术在肿瘤转移调控研究中的应用[J];生物技术通讯;2000年03期

9 魏文科,侯建军,向武良;肿瘤转移相关因素研究现状[J];湖北民族学院学报(医学版);2002年03期

10 梁莉;肿瘤转移的机理[J];国外医学.护理学分册;2002年01期

相关会议论文 前10条

1 钱文慧;陆茵;陈磊;孙志广;郑仕中;张伟伟;;血小板活化介导的肿瘤转移及中药治疗前景展望[A];中华中医药学会中药实验药理分会第八届学术会议论文摘要汇编[C];2009年

2 方伟岗;王锡山;;大会主席致辞[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会摘要集[C];2011年

3 赖小平;;41例肿瘤转移特点分析[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

4 李春海;;肿瘤转移生物学标志及其临床意义[A];全国肿瘤诊断与治疗药物分子靶点研究进展学术研讨会资料汇编[C];2005年

5 李杰;孙桂芝;吴志奎;;中药在抗肿瘤转移防复发中分子机理研究[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

6 何玉龙;;血管内皮细胞生长因子受体-3介导的信号通路在淋巴性肿瘤转移过程中的作用[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

7 宋纯;;肿瘤转移早期模型的建立、转移机制及药物干预研究[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会摘要集[C];2011年

8 陈龙邦;臧静;王靖华;胡守友;周晓军;;β-榄香烯抗肿瘤转移作用的研究[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

9 谢仰民;李恩民;;免疫缺陷动物在研究肿瘤转移方面的应用[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年

10 高艳光;曾宪录;;化学修饰肝素与肿瘤转移关系的研究[A];吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C];2008年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 夏茂盛;捷科学家发现导致肿瘤转移新基因[N];光明日报;2013年

2 记者 刘冬梅;全国肿瘤转移大会在津开幕[N];天津日报;2009年

3 程祖亨;可怕的肿瘤转移[N];农村医药报(汉);2012年

4 记者 李天舒;新研究找到抑制肿瘤转移靶点[N];健康报;2011年

5 张田勘;揭开肿瘤转移的秘密[N];健康报;2003年

6 记者 周颖;中西医结合防治肿瘤转移有增效优势[N];中国中医药报;2005年

7 衣晓峰;肿瘤转移能力“与生就有”[N];中国医药报;2011年

8 马一鸣;肿瘤转移机制及其阻断——癌扩散的基础和临床[N];健康报;2005年

9 通讯员 杨叁平 李瑞;国际研究发现中药可切断肿瘤转移通路[N];科技日报;2012年

10 记者 任壮;中药可抑制肿瘤转移[N];中国中医药报;2012年

相关博士学位论文 前10条

1 杨剑;Rab3D蛋白促进肿瘤转移和Hsp90α质膜转运信号的研究[D];清华大学;2015年

2 何欣榆;针对肿瘤转移过程的纳米药物递释系统抗乳腺癌转移的研究[D];中国科学院上海药物研究所;2016年

3 王慧;抗糖尿病药物中激活Nrf2通路的抗氧化剂对肿瘤转移的影响及机制研究[D];第三军医大学;2016年

4 张觉超;髓源抑制细胞（MDSC）促进肿瘤转移的作用和机制研究[D];东北师范大学;2016年

5 刘文生;NDRG1蛋白对结直肠癌肿瘤转移调控机制初探[D];上海交通大学;2015年

6 贾荣杰;细胞表型转化促进肿瘤转移的新机制研究[D];第二军医大学;2016年

7 段晓品;刺激响应性聚合物胶束在抗肿瘤转移及逆转肿瘤耐药中的应用[D];沈阳药科大学;2013年

8 宋安萍;联合抑制消减杂交及基因芯片技术筛选肿瘤转移效应基因[D];华中科技大学;2007年

9 李晓丽;温通降浊法抗肿瘤转移研究[D];山东中医药大学;2004年

10 贾海泉;mag-1与肿瘤转移的相关性及其机制的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 王忠;肿瘤转移机理的中医基础理论研究[D];北京中医药大学;2006年

2 王淙悦;肿瘤转移临床特点与用药规律研究[D];辽宁中医药大学;2014年

3 孙艳;髓清丸抗肿瘤转移的临床及实验研究[D];广州中医药大学;2010年

4 张家恺;LPAAT蛋白家族与肿瘤转移相关性的研究[D];安徽农业大学;2011年

5 宁耀贵;花生四烯酸细胞色素P450表氧化酶促进人类肿瘤转移[D];华中科技大学;2006年

6 于红阳;整合素和PAR1参与凝血酶促肿瘤转移作用的研究及其机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

7 张巧姝;KAI1/CD82胞外结构域小环在抑制肿瘤转移中的作用及调控机制的研究[D];大连医科大学;2014年

8 佟玲;大黄木香有效成分预防肿瘤转移的实验研究[D];辽宁中医学院;2005年

9 焉雷;TLR4在肿瘤转移中的作用及机制研究[D];第二军医大学;2014年

10 于进波;HS影响肿瘤转移的实验研究[D];南京中医药大学;2007年

本文编号：2526854