microRNA-26b-5p在肝癌上皮间充质转化和血管生成拟态形成中的作用研究

发布时间：2019-08-16 15:30

【摘要】：研究目的已报道Twist1及micro RNAs(mi RNAs)在肿瘤的进展过程中发挥重要作用,涉及肿瘤的侵袭、转移、血管形成及上皮间充质转化等多方面。然而,Twist1和mi RNAs之间的关系以及mi RNAs在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用尚未明确。本研究目的在于找出Twist1促进上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)过程中所涉及的主要mi RNAs,并研究其在HCC进展中发挥的作用,为开展针对Twist1及其相关分子生物学事件的肿瘤分子诊断、治疗和/或预后策略奠定基础。研究方法1、通过mi RNAs表达谱芯片及Chip-seq技术,筛选出Twist1过表达时变化明显的mi RNAs,并应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)和Ch IP(chromatin immunoprecipitation)-PCR方法验证结果的可靠性。2、应用q RT-PCR的方法检测人体肝细胞肝癌冰冻组织中所筛选的mi RNAs的表达情况,并分析其与病人临床病理资料之间的关系。3、应用q RT-PCR的方法检测人体肝细胞肝癌组织中Twist1的表达,并进一步分析其与所筛选mi RNAs的相关性。4、应用q RT-PCR的方法筛选出低表达及高表达所筛选mi RNAs的HCC细胞系,通过质粒转染的方法分别上调及下调目标mi RNAs,并筛选出相应的稳转细胞系。随后,q RT-PCR验证mi RNAs转染效果,q RT-PCR及Western Blot分别检测EMT相关分子及VM相关分子在m RNA和蛋白水平的变化,免疫荧光检测EMT及VM相关分子(E-cadherin、vimentin、VE-cadherin)的表达情况。5、运用侵袭实验、迁移实验、MTT、粘附实验、平板克隆形成实验及体外三维培养实验检测mi RNAs对HCC细胞侵袭、迁移、增殖及管道形成能力的影响。6、通过TargetScan,Pic Tar和mi Randa数据库预测所筛选miRNAs下游的靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验验证mi RNAs与靶基因可直接结合。在低表达所筛选mi RNAs的HCC细胞系中,通过上调mi RNA及同时上调mi RNA与靶基因,应用q RT-PCR、Western Blot及功能实验(侵袭实验、迁移实验、MTT、平板克隆形成实验及体外三维培养实验)的方法,进而验证mi RNA与靶基因的相互作用。7、应用qRT-PCR的方法检测人体肝细胞肝癌组织中所预测靶基因及其相关分子的表达,并进一步分析这些分子与所筛选mi RNAs的相关性。8、应用qRT-PCR、Western Blot选出共表达且中等量表达Twist1及靶基因的HCC细胞系,通过上调靶基因及同时上调mi RNAs与靶基因,应用q RT-PCR、Western Blot及功能实验(侵袭实验、迁移实验、MTT、平板克隆形成实验及体外三维培养实验)的方法,从另一角度进一步验证mi RNAs的作用及其与靶基因的相互作用。9、通过将稳定过表达所筛选mi RNAs和稳定降表达所筛选mi RNAs的HCC细胞接种到裸鼠体内,构建裸鼠移植瘤模型,进而观察所筛选mi RNAs对HCC细胞成瘤能力及移植瘤生长的影响。同时应用免疫组化及Endomucin/PAS双染技术检测瘤组织中EMT及VM相关蛋白的表达情况及VM的形成情况,进一步验证mi RNAs对HCC疾病进展的影响。10、在中等表达Twist1及靶基因的HCC细胞系,通过上调靶基因及同时上调mi RNAs与靶基因,应用Western Blot的方法检测mi RNAs靶基因的上游和下游转录因子的表达情况,以进一步研究所筛选的mi RNAs所涉及的信号通路。研究结果1、HCC细胞系Hep G2中Twist1的过表达引起多种mi RNAs的表达变化,其中mi RNA-26b-5p(mi R-26b-5p)的表达明显降低(P0.005),q RT-PCR验证此结果。此外,Ch IP-PCR结果证实Twist1蛋白可与mi R-26b-5p的编码基因在DNA水平直接结合。2、在HCC组织中,mi R-26b-5p的表达明显低于癌旁组织,且mi R-26b-5p的表达与HCC患者的早期复发、转移有关(Log Rank,P=0.01)。3、与癌旁正常肝组织相比,HCC人体组织中,Twist1呈高表达。Twist1的表达与mi R-26b-5p的表达呈负相关(P=0.004,r=-0.572)。4、在HCC细胞系(H7402,Bel7402,SMMC7721,Hep G2,PLC,HCCLM3,MHCC97L,Huh7)和正常肝癌细胞系LO2中,筛选出低表达mi R-26b-5p的肝癌细胞系Bel7402,SMMC7721,高表达mi R-26b-5p的肝癌细胞系Hep G2,PLC。上调mi R-26b-5p的肝癌细胞系Bel7402和SMMC7721(Bel7402-mi R-26b-5p,SMMC-mi R-26b-5p),在m RNA和蛋白水平,均表现为E-cadherin表达增高,vimentin、VE-cadherin表达降低。下调mi R-26b-5p的肝癌细胞系Hep G2和PLC(Hep G2-mi R-26b-5p-inhibitor和PLC-mi R-26b-5p-inhibitor),在m RNA和蛋白水平,均表现为E-cadherin表达降低,vimentin、VE-cadherin表达增高。5、肝癌细胞系Bel7402,SMMC7721过表达mi R-26b-5p后,细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力减弱(P0.05)。肝癌细胞系Hep G2,PLC降表达mi R-26b-5p后,细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力增强(P0.05)。6、Target Scan,Pic Tar及mi Randa数据库预测并筛选出mi R-26b-5p下游的靶基因SMAD1并通过双荧光素酶报告基因实验验证mi R-26b-5p可与SMAD13’—非编码区(untranslated region,UTR)直接结合。Bel7402-mi R-26b-5p细胞系上调SMAD1表达后,在m RNA和蛋白水平,均表现为E-cadherin表达降低,vimentin、VE-cadherin表达增高。同时,与过表达mi R-26b-5p时相比,细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力增强(P0.05)。7、与癌旁正常肝组织相比,HCC人体组织中,SMAD1呈高表达;SMAD1的表达与mi R-26b-5p的表达呈负相关(P=0.035,r=-0.442)。与癌旁正常肝组织相比,HCC人体组织中,BMP4呈高表达;BMP4的表达与mi R-26b-5p的表达呈负相关(P=0.010,r=-0.524),其与SMAD1的表达呈正相关(P=0.029,r=0.455)。8、Hep G2和97L为中等共表达Twist1及SMAD1的HCC细胞系,两种细胞系分别上调SMAD1,mi R-26b-5p及同时上调mi R-26b-5p与SMAD1后,在m RNA和蛋白水平,均表现为SMAD1上调组E-cadherin表达相对最低,vimentin、VE-cadherin表达相对最高;mi R-26b-5p上调组E-cadherin表达相对最高,vimentin、VE-cadherin表达相对最低;mi R-26b-5p与SMAD1同时上调组E-cadherin,vimentin、VE-cadherin的表达介于上述两组之间。SMAD1上调组细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力明显增强;mi R-26b-5p上调组细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力明显减低;mi R-26b-5p与SMAD1同时上调组细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成能力介于上述两组之间。9、SMMC-mi R-26b-5p移植瘤成瘤率低(75%),生长慢,肿瘤体积小,肿瘤组织中EMT及VM相关蛋白(vimentin、VE-cadherin、β-catenin、MMP2、Snail)表达均减弱,Smad1、BMP4蛋白表达降低,E-cadherin表达增高,Twist1表达无明显变化;Hep G2-mi R-26b-5p-inhibitor移植瘤成瘤率高(100%),肿瘤生长慢、体积小,肿瘤组织中EMT及VM相关蛋白(vimentin、VE-cadherin、β-catenin、MMP2、Snail)表达均增高,Smad1、BMP4蛋白表达增高,E-cadherin表达降低,Twist1表达无明显变化。10、HepG2和97L为同时中等表达Twist1及SMAD1的HCC细胞系,两种细胞系分别上调SMAD1,mi R-26b-5p及同时上调mi R-26b-5p与SMAD1后,在蛋白水平,Smad1、β-catenin、Snail、Slug的相对表达均表现为SMAD1上调组相对最高;mi R-26b-5p上调组相对最低;mi R-26b-5p与SMAD1同时上调组表达介于上述两组之间。BMP4的表达在SMAD1上调组无明显变化;mi R-26b-5p上调组相对最低;mi R-26b-5p与SMAD1同时上调组表达介于上述两组之间。Eph A2、SIP1及Wnt5α的相对表达在上述各组之间无统计学差异。结论1、Twist1通过直接结合mi R-26b-5p启动子区序列而下调其表达。2、在HCC组织和细胞中mi R-26b-5p与Twist1的表达水平呈负相关,mi R-26b-5p的低表达与病人的不良预后相关。3、mi R-26b-5p的表达与EMT的表型相关,且能抑制EMT和VM的发生。4、在体外,mi R-26b-5p抑制HCC细胞迁移、侵袭、粘附、增殖、克隆形成和管道形成能力;在体内,mi R-26b-5p抑制肿瘤形成和肿瘤血管形成。5、SMAD1是mi R-26b-5p的靶基因,SMAD1的上调能部分削弱mi R-26b-5p介导的对EMT和VM的抑制作用以及对肿瘤细胞生物学功能的抑制作用。6、mi R-26b-5p通过靶向下调SMAD1的表达,而抑制BMP4/Smad1信号通路,进而发挥其抑制EMT和VM的功能。
【图文】：

聚类分析,芯片,筛选条件,信号值

miRNA芯片所筛选的47个差异miRNAs的聚类分析

分析结果图,芯片,细胞系,预测结果

15图 1-2 MA0235.1 和 MA0324.1 的 motif 分析结果1.2.3 qRT-PCR 及 ChIP-PCR 验证 miRNA 芯片和 ChIP-seq 分析的基于 miRNA 芯片和 ChIP-seq 分析的预测结果，我们取两者6 个 miRNAs：hsa-miR-1246，hsa-miR-1260b，，hsa-miR-128，hshsa-miR-26b-5p ， hsa-miR-27a-3p 。应用 qRT-PCR 及 ChIP-PChsa-miR-26b-5p 和 hsa-miR-27a-3p 为例，验证 miRNA 芯片数据据的可靠性。qRT-PCR 实验结果显示在 HepG2 细胞系中，TwismiR-26b-5p 和 miR-27a-3p 表达下降（见图 1-3）。我们于 m
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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