EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ慢病毒表达载体的构建与鉴定

发布时间：2019-08-29 16:59

【摘要】：背景过继免疫治疗(adoptive immunotherapy, AIT)是肿瘤免疫治疗的重要方法之一,显现出了一定的抗肿瘤作用。近年来,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)修饰T淋巴细胞的靶向免疫治疗新策略,赋予T淋巴细胞持久的生命力,更强的增殖性,靶向杀伤活性,进一步提高了AIT的疗效。表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receper variantⅢ EGFRvⅢ)在脑胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达率较高,与肿瘤的发生、发展密切相关,是肿瘤靶向治疗的理想分子靶点。本研究设计第三代嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ,构建慢病毒表达载体,为嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞的肿瘤免疫治疗提供实验条件。目的构建嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 C慢病毒表达载体,包装嵌合抗原受体基因表达的慢病毒,体外感染293T细胞,使之高效表达该基因,为提高过继免疫治疗的抗肿瘤活性提供实验基础。方法靶向EGFRvⅢ的第三代嵌合抗原受体由EGFRvⅢscFv (726bp)、铰链区和跨膜区(213bp), CD28 (123bp)、CD137胞内信号区(126bp), CD3ζ链(336bp)组成,通过Oligo化学合成、PCR扩增方法,成功合成嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 ζ的基因,将目的基因克隆入载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 的 EcoR1和BamH1位点,进行双酶切及测序验证后,与慢病毒包装质粒pVSVG;和pDe18.9共转染293T细胞包装成慢病毒,测定病毒滴度,慢病毒感染293T细胞,Western blot检测目的基因表达。结果EGFRvⅢscFv和基因合成的CD28-CD137-CD3 ζ片段,通过重叠PCR拼接成EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 ζ (EGFRvⅢ/CAR),目的基因EGFRvⅢ/CAR和表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP通过EcoR1和BamH1双酶切后连接,经过双酶切和测序证实目的基因EGFRvⅢ/CAR克隆入慢病毒表达载体内并且序列正确,成功包装了慢病毒,病毒滴度为1.5×108TU/ml,感染293T细胞、提取细胞中的蛋白质,CD3ζ抗体免疫印迹证实EGFRvⅢ/CAR的表达(分子量约58KDa)。结论成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢ/CAR慢病毒表达载体,成功制备慢病毒,慢病毒感染293T细胞后,目的基因能高效的表达,为慢病毒介导的嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞靶向治疗肿瘤的研究奠定基础。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.51

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本文编号：2530643