长链非编码RNA-H19与胃癌相关成纤维细胞活化的相关性研究

发布时间：2019-09-08 15:06

【摘要】：研究目的对小鼠胃粘成纤维细胞(Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF)进行原代分离培养,并构建其体外活化模型,以模拟体内胃癌相关成纤维细胞的活化,在此基础之上探索长链非编码RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19,lncRNA-H19)与胃癌相关成纤维细胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化的相关性。研究方法用组织块法对小鼠(C57BL/6小鼠)的胃粘膜成纤维细胞进行原代分离培养。成功培养后,在光学显微镜下对其形态学特征进行鉴定,同时辅以免疫荧光染色鉴定细胞内波形丝蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)的表达的表达情况,以进一步确认其细胞来源并分析纯度;在成功对小鼠胃粘成纤维细胞进行分离培养后,利用与小鼠胃癌细胞(MFC)共培养加上间隙性缺氧处理的方法构建GCAF的体外活化模型,以模拟胃癌微环境中GCAF的活化过程。建模后,利用ELISA法对细胞培养液中重要的活化效应分子进行检测,利用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)分别对活化相关蛋白mRNA进行检测,同时利用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞技术分别对GCAF体外活化模型进行细胞增殖、迁移及凋亡实验,并用CCK-8法检测MGMF、GCAF分别与MFC共培养后MFC的增殖活力变化,以验证GCAF体外活化模型构建是否成功;在成功建模的基础上,利用qPCR方法对比分析MGMF及GCAF中lncRNA-H19基因的表达情况,以验证lncRNA-H19与GCAF的活化有相关性。同时,我们进一步利用siRNA干扰基因表达的方法,对GCAF中的lncRNA-H19基因进行干扰沉默,随后用ELISA法检测干扰后相关活化因子的表达情况,利用CCK-8法、Transwell侵袭实验及流式细胞技术分别对干扰表达后的GCAF进行细胞增殖、侵袭及凋亡实验,以进一步证实lncRNA-H19与GCAF的活化有明确相关性。均值的比较采用独立样本t检验或方差分析。研究结果光学显微镜下见所分离的细胞呈梭状或两头尖的长条状,大小较均一,呈贴壁放射状生长,符合成纤维细胞的形态特征。免疫荧光染色技术鉴定结果显示波形丝蛋白(Vimentin)表达阳性,而结蛋白(Desmin)表达阴性,符合成纤维细胞的蛋白表达特征;活化模型建立后,GCAF培养液中重要活化效应分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表达量均较MGMF明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。同时,GCAF细胞内的α-SMA、FAP相关mRNA的相对表达量也均明显高于MGMF(P0.05)。另外,细胞功能实验显示,GCAF的增殖活性及迁移能力较MGMF明显增强,而细胞凋亡明显降低,且GCAF能明显促进MFC的增殖,差异有统计学意义(P0.05);qPCR法对细胞内的lncRNA-H19表达情况检测显示,GCAF的表达量较MGMF显著上调(2.10±0.14 VS.1.00±0.09,P0.001)。而lncRNA-H19干扰表达后,GCAF培养液中前述重要活化效应分子的表达量显著下降(P0.05),同时细胞的增殖活性及侵袭能力也显著降低,而细胞凋亡率则显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。研究结论LncRNA-H19与GCAF的活化具有明显的相关性,抑制LncRNA-H19的表达可以抑制GCAF的增殖与侵袭,并促进其凋亡,这提示LncRNA-H19有可能成为胃癌的临床治疗的一个新靶点。因此进一步对LncRNA-H19参与GCAF活化的具体机制研究十分必要。
【图文】：

胃粘膜,小鼠,杂细胞,成纤维细胞

第二军医大学硕士学位论文（11）荧光显微镜观察并拍照记录。三、实验结果1、形态学特征是目前成纤维细胞鉴定的主要方法，本实验在显微镜下对所分离的小鼠胃粘膜成纤维细胞进行形态学观察显示，当细胞首次长满培养基时，可见细胞以长条形或梭型为主，但其中也参杂有一些杂细胞，如图 1.1 所示；当进行纯化并传代后，细胞呈梭状或两头尖的长条状，轴突较长，，大小较均一，呈贴壁放射状生长，符合成纤维细胞形态。而杂细胞明显减少，细胞纯度理想，如图 1.2 所示。

胃粘膜,小鼠,杂细胞,下传

以长条形或梭型为主，但其中也参杂有一些杂细胞，如图 1.1 所示；当进行纯化并传代后，细胞呈梭状或两头尖的长条状，轴突较长，大小较均一，呈贴壁放射状生长，符合成纤维细胞形态。而杂细胞明显减少，细胞纯度理想，如图 1.2 所示。 100 倍 200 倍图 1.1 普通光学显微镜下未进行纯化传代的小鼠胃粘膜成纤维细胞的形态特点
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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