冬凌草甲素对胆囊癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用及其分子机制

发布时间：2019-09-09 11:35

【摘要】：研究背景与目的:胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤,早期诊断困难,恶性程度较高,易发生侵袭转移,预后极差。由于缺乏特异的临床症状及体征,大多数病例发现时往往已是晚期,失去手术机会。患者预后不理想的主要原因是由于术后的复发转移率较高,且肿瘤对目前常规放化疗方法不敏感。因此,亟需探索治疗胆囊癌的新手段。冬凌草甲素是从冬凌草等植物中提取出来的一种二萜类天然活性物质,具有抗炎、抗DNA突变、抗氧化作用。目前研究表明,冬凌草甲素对多种恶性肿瘤都有促凋亡作用。因此,本课题旨在探讨冬凌草甲素在体内及体外对胆囊癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用及其机制,为胆囊癌化疗探索新途径。方法:1.冬凌草甲素诱导胆囊癌细胞凋亡及细胞周期阻滞通过MTT实验、克隆形成实验观察冬凌草甲素对胆囊癌细胞增殖影响;利用流式细胞仪及Hoechst 33342染色分析冬凌草甲素对胆囊癌细胞凋亡及细胞周期的影响;裸鼠成瘤实验检测冬凌草甲素在体内对胆囊癌细胞的增殖及凋亡影响。2.冬凌草甲素诱导胆囊癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的分子机制通过流式细胞仪检测线粒体膜电位、Caspase活性实验探讨冬凌草甲素诱导胆囊癌细胞凋亡的机制;采用Western blot实验检测冬凌草甲素作用后,胆囊癌细胞凋亡及周期相关蛋白表达情况。3.冬凌草甲素通过调节HER2基因表达诱导胆囊癌细胞凋亡通过Real-Time PCR及Western blot实验,检测冬凌草甲素作用后,胆囊癌细胞中HER2基因在m RNA及蛋白水平的表达情况;构建HER2过表达质粒,通过流式检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白改变情况。收集77例胆囊癌患者及70例胆囊炎患者手术切片及临床病理资料,通过免疫组织化学法检测两组HER2阳性率,与反映细胞增殖的指标Ki-67表达的相关性分析,探讨HER2过表达与胆囊癌患者临床病理资料及预后的关系。结果:冬凌草甲素对胆囊癌细胞有明显的杀伤效果,且冬凌草甲素浓度越高,孵育的时间越长,其杀伤作用就越显著,呈剂量、时间依赖性。随着冬凌草甲素作用浓度增加,胆囊癌细胞早期凋亡率明显增加,同时其晚期凋亡率上升更为显著,出现典型凋亡形态改变;同时细胞线粒体膜电位降低、线粒体完整性被破坏,细胞内的caspase-3,-9活性上升,而caspase-8活性无明显改变;在蛋白水平,NF-κB表达下降,胞质中Bax/Bcl-2比例上升,诱导线粒体内细胞色素C向胞质释放,激活下游的caspase-3,诱发细胞凋亡。冬凌草甲素处理后,胆囊癌细胞中处于G0/G1期的细胞比例显著降低,S期的细胞比例显著升高,发生S期阻滞,cyclin A及cyclin B1表达明显下降,而cyclin D1表达上升。裸鼠成瘤实验发现,冬凌草甲素组裸鼠成瘤体积及重量比对照组都明显减小,差异有统计学意义(P0.01)。进一步研究发现冬凌草甲素能显著下调胆囊癌细胞HER2基因的表达;过表达HER2后,能部分逆转冬凌草甲素的抗肿瘤效应。胆囊癌患者HER2阳性率明显高于胆囊炎患者(46.7%vs.0%)。胆囊癌患者中HER2的表达与的病理分期有关,III-IV期患者HER2阳性率明显高于0-II期患者(59.6%vs.26.7%)。HER2蛋白表达与Ki-67表达呈正相关(Kappa系数=0.376,P=0.001)。胆囊癌患者HER2表达阳性与阴性的中位生存时间分别为18.5个月和23.5个月,1年及3年生存率分别为27.7%、16.9%和63.4%、25.1%,HER2阴性患者预后明显优于HER2阳性患者,且HER2的表达量及病理分期是影响患者预后的两个独立危险因素。结论:冬凌草甲素通过下调HER2/neu基因的表达激活线粒体凋亡途径,诱导胆囊癌细胞凋亡及发生S期阻滞。冬凌草甲素有望成为胆囊癌化疗的新手段。
【图文】：

ErbB 信号转导通路突变（包括 EGFR、ErbB多因素分析显示 ErbB 相关通路的突变提示患其下游基因的突变对胆囊癌的发生发展起着至究有望为胆囊癌的预后判断及治疗寻找到一个通过基础实验研究和临床病理分析，探讨冬凌细胞周期阻滞的作用及其可能的分子机制。通验、细胞周期及凋亡实验、Hoechst 染色、线粒癌细胞的增殖及凋亡影响；通过 Western blo细胞凋亡及细胞周期阻滞可能的分子机制。通2/neu 基因在胆囊炎和胆囊癌临床标本中表达i-67 表达的相关性分析，探索 HER2/neu 与胆冬凌草甲素成为一种具有潜在应用价值的新型

上海交通大学博士学位论文20μmol/L，而 NOZ 细胞的 IC50约为 10μmol/L。4）在特定的冬凌草甲素浓度培养条件下，孵育的时间越长，冬凌草甲素对于胆囊癌细胞的杀伤作用就越显著，，呈时间依赖性。于是，我们选取 IC50周围 7.5，15 及 30μmol/L 三个浓度梯度完成后续实验。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.8

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本文编号：2533567