核心蛋白聚糖抑制结直肠腺癌细胞HCT116的体外侵袭作用

发布时间：2019-09-11 15:34

【摘要】：背景在我国,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是目前引起肿瘤相关性死亡的第五大病因,其中CRC的复发和转移是引起结直肠癌患者死亡的主要原因。对于实体肿瘤来说,肿瘤组织边缘部位供血充分、氧分压高,越靠近中心区域氧分压越低,从而导致中心区域肿瘤细胞发生缺氧坏死、产生低氧耐受,并且不同的氧分压对细胞的生长有着不同形式的影响;对于一个实体肿瘤来说,存在着常氧和低氧等多种微环境。因此,研究不同微环境下CRC的侵袭转移机制有重要的意义。研究表明:decorin(DCN)作为一种核心糖蛋白,与相关受体结合并内化分解致酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTKs)抵抗,从而抑制多种肿瘤细胞的体外增殖和迁移,如肺癌、肾癌、结直肠癌。但DCN抑制结直肠癌细胞体外侵袭的作用及机制尚不十分清楚,本研究将探讨在常氧和低氧条件下DCN对结直肠腺癌细胞HCT116体外侵袭能力的影响及其可能机制。目的本文探讨在常氧和CoCl_2诱导的低氧环境下,DCN对人结直肠腺癌细胞HCT116体外侵袭的作用,并探讨和比较常氧和CoCl_2诱导的低氧条件下DCN与HIF-1α/CD133/TIMP-2通路的关系,从而为临床实体肿瘤的治疗提供新的思路。方法用化学性低氧模拟剂CoCl_2处理人结直肠腺癌细胞HCT116,建立化学性低氧模型;在此低氧模型的基础上,用DCN处理HCT116细胞:(1)通过MTT法检测常氧和低氧环境下DCN对HCT116细胞体外增殖能力的影响;(2)Transwell体外侵袭实验检测常氧和低氧环境下DCN对HCT116细胞体外侵袭能力的影响;(3)Real-time PCR法检测常氧和低氧环境下DCN对HCT116细胞CD133和TIMP-2 mRNA表达的影响;(4)Western blot法检测常氧和低氧环境下DCN对HCT116细胞中HIF-1α、CD133和TIMP-2蛋白表达的影响。结果一、筛选适宜浓度的CoCl_2,建立化学性低氧模型1.1 MTT结果:CoCl_2对HCT116细胞的抑制作用具有剂量依赖性,随着CoCl_2浓度的增加,抑制作用逐渐增加(P0.05)。1.2 Western blot结果:CoCl_2对HCT116细胞HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白的表达有双向调节作用,随CoCl_2浓度的升高HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白的表达先升高后降低。本实验研究CoCl_2诱导的低氧环境中DCN抑制HCT116细胞的体外侵袭机制,因此结合上述结果,选取对细胞增殖影响小并对HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白表达改变较大的100μmol/LCoCl_2进行后续实验。二、不同浓度的DCN对HCT116细胞增殖能力的影响MTT法检测不同浓度的DCN对HCT116细胞增殖能力的影响,结果显示,DCN浓度为0.5、1和3 mg/L时对HCT116细胞的增殖无明显抑制作用(P0.05);DCN浓度为6 mg/L时,HCT116细胞的增殖能力明显下降(P0.01)。后续实验选择1 mg/L和3 mg/L的DCN进行体外侵袭实验。三、常氧和低氧条件下DCN抑制HCT116细胞的体外侵袭能力3.1 Transwell体外侵袭实验检测常氧条件下DCN对HCT116细胞体外侵袭能力的影响,结果显示,DCN浓度为0、1和3 mg/L时HCT116细胞的侵袭数分别为(241±46)、(168±46)和(51±17)个/视野(10×10倍)(P0.01)。3.2 Transwell体外侵袭实验检测低氧条件下DCN对HCT116细胞体外侵袭能力的影响,结果显示,CN、CoCl_2、CoCl_2+DCN(1 mg/L)和CoCl_2+DCN(3 mg/L)各组细胞的侵袭数分别为(207±61)、(213±64)、(156±54)和(44±17)个/视野(10×10倍)(P0.01)。四、常氧和低氧条件下DCN对HCT116细胞中TIMP-2、CD133 mRNA表达的影响4.1 Real-time PCR结果显示:在常氧条件下DCN(3 mg/L)显著上调HCT116细胞中TIMP-2 mRNA的表达(P0.01),而对CD133 mRNA的表达无明显影响(P0.05);4.2 Real-time PCR结果显示:在CoCl_2诱导的低氧条件下DCN(3 mg/L)显著下调HCT116细胞中TIMP-2 mRNA的表达(P0.01),而对CD133 mRNA的表达无明显影响(P0.05)。五、常氧和低氧条件下DCN对HCT116细胞HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白表达的影响5.1 Western Blot结果显示:常氧条件下DCN(3 mg/L)明显上调TIMP-2的表达(P0.01)和HIF-1α的表达(P0.05),而对CD133的表达无明显作用(P0.05);5.2 Western Blot结果显示:在CoCl_2诱导的低氧环境中DCN(3 mg/L)明显下调HCT116细胞中HIF-1α、CD133、TIMP-2蛋白表达(P0.01)。结论1.DCN可以抑制人结直肠腺癌细胞HCT116的体外增殖能力,且呈浓度依赖性;2.在常氧和CoCl_2诱导的低氧环境中,DCN均可以抑制人结直肠腺癌细胞HCT116的体外侵袭能力,且有浓度依赖性;3.在常氧和CoCl_2诱导的低氧环境中,DCN抑制人结直肠腺癌细胞HCT116的体外侵袭能力可能通过不同机制发挥作用。低氧条件下可能通过调节HIF-1α/CD133/TIMP-2通路发挥作用;常氧条件下可能主要通过促进TIMP-2的表达来发挥作用,而与HIF-1a/CD133通路无关。
【图文】：

细胞增殖,作用时间,浓度

表 1 CoCl2对 HCT116 细胞增殖的影响Tab.1 The inhibition rate of HCT116 cells in CoCl2group （错误！未n=6）细胞增殖抑制率%分组 n24 h 48 h 空白对照组 6 0.000±2.345 0.000±6.795 50 μmol/L·CoCl26 19.990±1.285a16.350±8.787a9100 μmol/L·CoCl26 32.505±9.502a11.936±5.485b1250 μmol/L·CoCl26 48.124±8.516a26.546±6.514ab3500 μmol/L·CoCl26 67.830±7.095a61.687±4.179a7750 μmol/L·CoCl26 72.285±5.456a83.930±1.204a8注：与同时间点空白对照组比较aP<0.05；同浓度 48 h 与 2P<0.01，72 h 与 48 h 之间的比较cP<0.01， 72 h 与 24 h 之间的比

癌细胞,蛋白表达,结直肠腺癌,双向调节

4.1.2 Western blot 法检测不同浓度的 CoCl2对 HCT116 细胞中 HIF-1α / CD133 /TIMP-2 蛋白表达的影响结果见图 2。CoCl2对 HCT116 细胞 HIF-1α/ CD133 / TIMP-2 蛋白的表达有双向调节的作用，随 CoCl2浓度的升高 HIF-1α/ CD133 / TIMP-2 蛋白的表达先升高后降低。因为我们将研究在 CoCl2诱导的低氧环境下 DCN 抑制结直肠腺癌细胞HCT116 的体外侵袭机制，因此结合上述结果，，我们选取了对细胞增殖影响小并且对 HIF-1α / CD133 / TIMP-2 蛋白表达改变较大的 100 μmol/L 浓度的 CoCl2进行后续实验。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】