肿瘤坏死因子α诱导蛋白8在胃腺癌侵袭转移中的作用研究

发布时间：2019-09-11 20:40

【摘要】：[研究背景与目的]：胃癌(gastric cancer, GC)是消化系统最常见的恶性肿瘤,也是全球范围内发病率第四位,死亡率第二位的肿瘤。在中国,居消化道恶性肿瘤发病率、死亡率首位。胃癌大多发病隐匿、恶性程度高、病情发展较迅速且容易发生远处转移,尽管随着医疗水平不断提高,在早期诊断及综合治疗方面取得了巨大进步,但手术切除依然是目前治愈胃癌的唯一手段。胃癌在不同区域间发病率变化较大,这与胃癌危险因素的分布息息相关。胃癌的危险因素主要包括：幽门螺杆菌感染、不良的生活习惯(吸烟、饮酒、烟熏盐渍食物等)、慢性萎缩性胃炎及胃溃疡等。胃癌的早期诊断率仍不足10%,中晚期胃癌预后很差。胃癌包括多种病理类型,其中胃腺癌占到了胃癌总数的90%,是本课题组的主要研究对象。胃癌的发生、发展和转移是多因素、多阶段、多基因参与的,研究参与此过程的易感基因以及相关细胞因子必定有助于了解胃癌的生物学行为和判定评估患者的预后。寻求有利于早期诊断、治疗及评价预后的有效生物学靶标是当前胃癌研究的重要内容之一。肿瘤坏死因子α诱导蛋白(tumor necrosis factor-alpha-induced protein,TNFAIP)家族,是由肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor a, TNFα)诱导产生的,通过NF-κB的激活而发挥作用,参与多种生物学过程。TNFAIP8家族蛋白属于此家族中新发现的一类,包括TIPE(TNFAIP8), TIPE1 (TNFAIP8L1), TIPE2 (TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3)。其蛋白质结构域中含有一个死亡结构域(death effecter domain, DED),在调节细胞增殖、调亡炎症发生发展等方面发挥重要作用,国内外相关研究表明,在人类多种实体肿瘤中,TNFAIP8过表达能加速细胞增殖,从而促使肿瘤生长；沉默TNFAIP8基因后,肿瘤细胞的增殖、生长明显减弱。认为TNFAIP8的表达与其发生、发展、浸润、转移以及不良预后有明显的相关性。由此可见,TNFAIP8在肿瘤浸润转移过程中可能起关键作用。但是,有关TNFAIP8在我国高发疾病胃癌中的相关研究报道较少,特别是目前国内外尚没有关于TNFAIP8的表达情况与临床病理特征包括肿瘤标志物血清CA72-4及预后关系的研究。同时TNFAIP8在胃癌侵袭转移中是如何发挥作用的机制尚不明确。本研究通过免疫组织化学方法检测TNFAIP8在胃腺癌原发灶、癌旁正常胃粘膜组织及相应淋巴结转移灶中的表达情况,并详细分析其表达水平与临床病理特征包括预后的关系。进一步采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,合成TNFAIP8基因小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)转染干扰胃癌细胞,观察TNFAIP8 siRNA转染对胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力的影响,并分析探讨TNFAIP8参与侵袭、转移的可能机制。[方法]：1. TNFAIP8在胃腺癌中的表达情况：选取山东省医科院附院病理科存档的106例胃腺癌原发灶及癌旁正常胃粘膜组织和相应60例淋巴结转移灶,这106例患者的临场资料也被统计。应用免疫组化方法检测TNFAIP8表达,分析TNFAIP8表达水平与胃腺癌患者临床病理特征的关系。生存分析方法评价TNFAIP8表达对胃腺癌患者预后的影响。2. TNFAIP8基因的干扰RNA体外合成及对胃癌细胞系的干预：使用Western Blot方法检测胃癌细胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表达量,筛选出TNFAIP8基因表达量最高的细胞系,合成TNFAIP8基因的干扰RNA(TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、TNFAIP8 siRNA3),并利用基因转染技术将三组干扰RNA分别转染进该胃癌细胞株,应用流式细胞仪观察转染效率,分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测基因转染后的TNFAIP8 mRNA和蛋白的表达,评价干扰效果。3. TNFAIP8对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制探讨：筛选出沉默效率最高的一组序列,采用平板实验检测各组细胞单克隆形成能力,CCK-8的方法检测细胞增殖能力的变化,采用Transwe11小室方法分别检测细胞侵袭能力及转移能力的变化,采用Western Blot方法检测细胞TNFAIP8基因转染前后胃癌相关基因(MMP-2、MMP-9)在蛋白水平上的表达变化,探讨TNFAIP8促进肿瘤细胞侵袭转移的可能机制。[结果]：1. TNFAIP8在癌旁相应淋巴结转移灶、胃腺癌原发灶、和正常胃粘膜组织中高表达率依次下降,分别为81.7%(49/60),47.2%(50/106)和0,三组间有统计学差异,两两比较也有显著统计学差异(P0.05)：且伴淋巴结转移原发灶的高表达率60.0%(36/60)明显高于无淋巴结转移的原发灶30,4(14/46),两者比较也有显著统计学差异(P0.05)。2. TNFAIP8表达与血管侵犯,TNM分期,T分级,淋巴结转移及外周血血清CA72-4水平呈正相关。3. Kaplan-Meier方法生存分析结果显示TNFAIP8表达与预后呈负相关,TNFAIP8高表达的胃腺癌患者总生存率低于TNFAIP8低表达的患者。Cox多因素分析结果表明TNFAIP8表达水平是胃腺癌患者独立的预后标志(RR1.736,P=0.029)。4.小干扰RNA转染：使用Western Blot方法检测胃癌细胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表达量,发现SGC7901中TNFAIP8基因的表达量最高。通过转染试剂HiperFect分别将TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、 TNFAIP8siRNA3和阴性对照siRNA转染入胃癌细胞SGC7901,结果TNFAIP8 siRNA2组的沉默效率最高,转染干扰序列后,TNFAIP8基因在RNA水平和蛋白水平的表达明显下降。5. TNFAIP8对胃癌细胞侵袭转移的影响及机制探讨：胃癌细胞SGC7901在干扰后,肿瘤细胞的单克隆形成能力、细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显下降,胃癌细胞中MMP-2、MMP-9在蛋白水平表达均下调。[结论]：1. TNFAIP8在胃腺癌中高表达,TNFAIP8在淋巴结转移灶中高表达率高于原发灶。研究TNFAIP8在胃腺癌中表达很有价值。2. TNFAIP8的表达水平与胃腺癌的侵袭转移呈正相关,与预后呈负相关,TNFAIP8对判断胃腺癌患者的预后有意义,亦可能成为一个潜在的治疗靶点。3. TNFAIP8 siRNA能够抑制胃癌细胞SCG7901中内源性TNFAIP8的表达。进一步研究发现TNFAIP8基因可以增强胃癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力,同时可以下调胃癌相关基因的表达,对胃癌的发生发展起到了重要作用。
【图文】：

胃腺癌

TNFAIP8在胃腺癌原发灶中的表达

免疫组化染色

TNFAIPB淋巴结转移灶中的表达(免疫组化染色X400)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】