BMSCs DNA损伤在AML耐药中的作用机制研究及Th细胞在AML中的异常表达

发布时间：2019-09-12 04:36

【摘要】：第一部分BMSCs DNA损伤分泌蛋白的筛选及在AML耐药中的作用鉴定研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一组遗传学异常、治疗反应和预后均有极大差异的造血系统恶性疾患,严重威害人类健康。迄今为止,以蒽环类和阿糖胞苷为主的联合化疗、新型靶向制剂以及造血干细胞移植虽较大程度改善了AML患者的生存,但仍有大部分患者因多药耐药而导致复发和死亡,临床预后极差。因此,深入探究AML耐药的发生机制及其逆转对策对于提高AML患者疗效、减少复发和改善预后具有重大临床意义。近年研究表明,骨髓微环境与白血病细胞相互作用在白血病多药耐药和复发中发挥重要作用。骨髓微环境主要由骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)、细胞外基质及各种可溶性因子构成,其中BMSCs是参与白血病细胞生存和耐药的最重要因素。研究报道,BMSCs可通过调节Bcl-2和Caspase-3,使HL60和HL60/VCR细胞对拓扑替康(TPT)的药物敏感性下降。另有研究发现,骨髓内皮细胞可促进AML细胞增殖,并抑制化疗药物诱导的AML细胞凋亡。我们前期研究发现,AML细胞可通过直接接触的方式影响骨髓内皮细胞的增殖、迁移和小管形成,从而参与白血病细胞耐药。由此可见,BMSCs可通过多种机制促进白血病细胞耐药,靶向BMSCs可能会成为克服AML耐药的有力手段。最新研究提示,化疗药物在诱导肿瘤细胞发生DNA损伤并导致其死亡或衰老的同时,也可诱导肿瘤微环境中的基质细胞发生DNA损伤,启动DNA损伤反应,并激活下游细胞因子的产生和分泌,这些细胞因子在介导肿瘤获得性耐药中发挥重要作用。研究发现,前列腺癌成纤维细胞经化疗处理后发生明显的DNA损伤并分泌一组表达明显升高的蛋白,其中WNT16B通过活化经典Wnt信号通路促进前列腺癌细胞的增殖和耐药。另有研究显示,阿霉素治疗淋巴瘤小鼠后,可诱导小鼠胸腺内皮细胞发生DNA损伤并分泌一类影响淋巴瘤细胞生存的细胞因子,如IL-6和TIMP-1。还有研究报道,乳腺癌内皮细胞和其它基质细胞经化疗损伤后分泌TNF-α, TNF-α通过活化NF-κB信号通路并提高CXCL1/2的表达,最终导致乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性下降。近期研究表明,化疗药物在杀伤白血病细胞的同时,也可损伤骨髓微环境中的基质细胞。然而,BMSCs DNA损伤后会释放哪些分泌型蛋白,这些分泌型蛋白又是通过何种机制介导白血病细胞耐药,目前均尚不明确,亟待进一步研究。研究目的：本课题拟研究化疗药物对BMSCs和脐静脉内皮细胞(HUVECs) DNA损伤的影响,并明确其分泌的条件培养基在AML耐药中的作用；筛选和验证BMSCsDNA损伤后条件培养基中的差异表达蛋白,并对其生物学功能和信号通路进行软件预测分析；体外鉴定BMSCs DNA损伤分泌蛋白中参与AML耐药的关键因子,并研究其在AML患者骨髓中的表达。预期揭示骨髓微环境介导AML耐药的新机制,对克服AML耐药、清除微小残留病变具有重要意义。研究方法：1.化疗药物对BMSCs和HUVECs DNA损伤的影响：将骨髓基质细胞系HS-5和HUVECs分别暴露于化疗药物阿霉素(ADR)、去甲氧柔红霉素(IDA)和阿糖胞苷(Ara-C)以及生理盐水(NS)24小时,细胞免疫荧光和Western blot方法检测DNA损伤标志物γ-H2AX和PARP1的表达。2. BMSCs和HUVECs DNA损伤后条件培养基对AML细胞生物学行为的影响。2.1 HS-5和HUVECs DNA损伤后条件培养基对AML细胞药物敏感性的影响：应用ADR、IDA和NS处理HS-5和HUVECs后的条件培养基培养AML细胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培养基为对照,每组分别加入不同浓度梯度的ADR和IDA,培养72小时后,CCK8方法检测AML细胞相对存活率的改变。2.2HS-5 DNA损伤后条件培养基对AML细胞增殖的影响：应用ADR和NS处理HS-5后的条件培养基培养THP-1和NB4细胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培养基为对照,CCK8方法检测细胞增殖并绘制生长曲线。3.HS-5与AML细胞直接共培养对AML细胞凋亡的影响：将HS-5与Kasumi-1细胞以不同比例直接共培养,并给予ADR处理48小时,AnnexinV/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡的改变。4.IL-6、IL-8和CYR61在DNA损伤后BMSCs中的表达：ELISA方法检测HS-5和原代骨髓间充质干细胞(MSCs)损伤前后的条件培养基中IL-6、IL-8和CYR61的蛋白表达；Real-Time RT-PCR方法检测IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和(或)Ara-C处理后的HS-5和MSCs中的mRNA表达。5.筛选BMSCs DNA损伤后条件培养基中的差异表达蛋白：收集ADR和NS处理HS-5后的条件培养基,应用蛋白芯片技术检测HS-5 DNA损伤前后条件培养基中分泌蛋白的表达情况,选取差异倍数较高的蛋白作为候选因子。6.验证蛋白芯片结果：Real-time RT-PCR方法检测ADR、IDA、Ara-C和NS处理后的HS-5中候选因子的mRNA表达。7.蛋白芯片结果的生物学功能和信号通路预测分析及验证：应用相关软件对蛋白芯片结果进行Go Term和显著性相关信号通路分析。应用IDA和NS处理HS-5后的条件培养基以及含有0.5% FBS的RPMI1640培养基培养THP-1和U937细胞6小时,Western blot方法对信号通路的预测分析结果进行验证。8.候选BMSCs DNA损伤分泌蛋白在AML患者骨髓中的表达：收集144例AML患者和34例正常对照骨髓标本,应用密度梯度心法分离骨髓单个核细胞,Real-time RT-PCR方法检测候选蛋白的mRNA:表达。9.体外鉴定BMSCs DNA损伤分泌蛋白中参与AML耐药的关键因子：将AML细胞饥饿过夜培养后,在培养基中加入不同浓度的候选蛋白或中和抗体,流式细胞术和CCK8方法检测候选蛋白对AML细胞凋亡、增殖或药物敏感性的影响。研究结果：1.证实化疗药物可诱导BMSCs和HUVECs DNA损伤：细胞免疫荧光和Western blot结果显示,与对照组(NS处理组)相比,γ-H2AX、PARP1在ADR、IDA或Ara-C药物处理后HS-5或HUVECs中的蛋白表达明显升高。2. BMSCs和HUVECs DNA损伤后条件培养基对AML细胞生物学行为的影响：2.1条件培养基对AML药物敏感性的影响：CCK8结果显示,在不同浓度ADR和IDA作用下,HS-5和]HUVECs DNA损伤后条件培养基组中AML细胞的相对存活率明显高于未损伤组和RPMI 1640组。2.2条件培养基对AML细胞增殖的影响：CCK8结果显示,ADR处理HS-5后的条件培养基对AML细胞的增殖无显著影响。3.HS-5与AML细胞直接共培养对AML细胞凋亡的影响：流式细胞术结果显示,HS-5与Kasumi-1细胞直接共培养可显著降低ADR诱导的Kasumi-1细胞凋亡。4. IL-6、IL-8HCYR61在DNA损伤后BMSCs中的蛋白和mRNA表达：4.1ELISA结果显示,与对照组相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR处理HS-5后条件培养基以及ADR和IDA处理MSCs后条件培养基中的蛋白水平未见明显升高。4.2 Real-time RT-PCR结果显示,与对照组相比,IL-6和IL-8在ADR和(或)IDA处理后的HS-5中的mRNA表达明显升高,而CYR61的mRNA表达无明显改变；与对照组相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和Ara-C处理后的MSCs中的mRNA均无显著改变。5.蛋白芯片筛选结果：应用蛋白芯片技术在ADR处理HS-5后的条件培养基中筛选出44个表达显著升高的分泌蛋白,其中差异较大的细胞因子为Activin A= 6Ckine、FGF-10、Betacellulin(BTC)、EG-VEGF和growth hormone (GH),作为候选因子。6.蛋白芯片结果的验证：Real-time RT-PCR结果显示,与对照组相比,Activin A、 6Ckine、FGF-10、BTC、EG-VEGF和GH在化疗药物处理后的HS-5中的mRNA表达明显升高,与芯片结果一致。7.蛋白芯片结果的生物学功能和信号通路分析及验证：显著性Go Term分析显示,这些DNA损伤分泌蛋白主要参与细胞生长、分化、凋亡、侵袭及信号转导等生物学功能；显著性相关信号通路分析显示,蛋白芯片筛选出的差异表达蛋白主要通过细胞因子与受体相互作用、ALK1、TGF-β、PI3K/AKT、JAK/STAT等通路发挥生物学功能。Western blot结果显示,IDA处理HS-5后的条件培养基可显著增强AML细胞中P38 MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平,与软件预测分析结果一致。8. BMSCs DNA损伤分泌蛋白在AML患者骨髓中的表达：Real-Time RT-PCR结果显示,Activin、6Ckine、FGF10.、EG-VEGF和GH在初诊和治疗后AML患者骨髓中的mRNA表达明显高于正常对照,且在治疗后患者骨髓中的mRNA表达明显高于初诊AML患者。9.体外鉴定BMSCs DNA损伤分泌蛋白中参与AML耐药的关键因子：9.1重组人Activin A或Activin A中和抗体对AML细胞增殖和药物敏感性的影响：CCK8结果显示,与对照组相比,Activin A组中Kasumi-1细胞的增殖未见显著改变；与对照组相比,在ADR和IDA作用下,ActivinA组中Kasumi-1细胞的相对存活率亦无明显改变；在应用IDA和NS处理HS-5后条件培养基以及含有0.5%FBS的RPMI 1640培养基培养THP-1细胞时,与对照组相比,Activin A中和抗体组中THP-1细胞的相对存活率未见显著改变。9.2重组人EG-VEGF对AML细胞凋亡、增殖和药物敏感性的影响：流式细胞术和CCK8结果显示,在不同浓度EG-VEGF作用下,THP-1细胞的凋亡率和增殖未见显著改变。在ADR和IDA作用下,随着EG-VEGF浓度的增加,THP-1细胞的相对存活率亦无明显改变。9.3重组人BTC对AML细胞凋亡、增殖和药物敏感性的影响：流式细胞术和CCK8结果显示,随着BTC浓度的增加,THP-1细胞的凋亡率呈现降低趋势而增殖速率逐渐增快。与对照组相比,在IDA作用下,随着BTC浓度的增加,THP-1细胞的相对存活率呈现升高趋势。9.4重组人FGF10可增强AML细胞对化疗药物IDA的抵抗：CCK8结果显示,与对照组相比,在IDA作用下,FGF10组中THP-1细胞的相对存活率明显升高。结论：1.化疗可诱导BMSCs和HUVECs发生DNA损伤,并通过分泌一组DNA损伤蛋白介导AML耐药。2. BMSCs DNA损伤分泌蛋白可能通过MAPK和STAT3信号通路参与AML耐药。3.外源性FGF10可降低AML细胞对化疗药物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCs DNA损伤介导AML耐药的关键因子。第二部分FGF10/FGFR2信号在BMSCs DNA损伤介导AML耐药中的作用机制研究研究背景：近年研究提示,肿瘤微环境赋予了肿瘤抗药物治疗的先天性耐受,靶向肿瘤微环境已成为肿瘤领域研究的热点。化疗、放疗以及其他应激均可诱导肿瘤微环境中的良性支持细胞发生DNA损伤并启动DNA损伤反应,导致大量细胞因子、生长因子和蛋白酶的产生和分泌,从而促进炎症、肿瘤血管形成、上皮-间充质转化、肿瘤细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,最终介导肿瘤耐药。因此,探索肿瘤微环境基质细胞DNA损伤分泌蛋白在肿瘤耐药中的作用及其上、下游调控机制可为肿瘤的靶向治疗提供新思路。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)是骨髓造血微环境的重要组成因子,在造血调控中发挥重要作用,并与白血病细胞的增殖、凋亡和耐药密切相关。FGF10又称胶质细胞生长因子2,是FGF家族成员之一,主要由成纤维细胞和其他间充质来源的细胞分泌。成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)是FGF的主要作用受体,属于酪氨酸激酶受体家族,包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4成员,其中FGFR2是FGF10的高亲和受体。近年研究表明,FGF10可通过自分泌和旁分泌的方式促进肿瘤细胞增殖,在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌和前列腺癌等多种实体瘤的存活中发挥重要作用。研究发现,FGF10可通过激活下游STAT1/P21、MAPK、PLC-γ和P13K通路促进肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡。另有研究显示,FGF10通过FGFR2诱导胰腺癌细胞的迁移和侵袭,导致预后不良。以上研究提示,FGF10/FGFR2信号在肿瘤耐药中发挥重要作用,有望成为克服肿瘤耐药的一个新靶点。在第一部分研究中,我们应用蛋白芯片技术筛选出44种BMSCs DNA损伤分泌蛋白,并对差异倍数较高的Activin A、6Ckine、FGF10、BTC、EG-VEGF和GH进行了验证。同时,我们通过进一步的生物学行为实验发现,外源性重组人FGF10可降低AML细胞对化疗药物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCsDNA损伤介导AML耐药的关键因子。然而,其具体调控机制目前尚不清楚。研究目的：本课题拟在第一部分研究基础上进一步探究BMSCs DNA损伤后分泌的FGF10在介导AML耐药中的具体机制。研究BMSCs DNA损伤后信号通路的改变并对其进行干预以寻找FGF10异常表达的上游调控机制；明确FGFRs在AML细胞系和AML患者骨髓中的表达以及BMSCs DNA损伤后条件培养基对AML细胞表面FGFRs表达的影响,并探讨FGF10对AML细胞表面FGFRs及下游信号通路的影响；应用FGFRs小分子抑制剂和FGFR2下调病毒探究靶向FGF10/FGFR2信号逆转AML耐药的可能性。本研究预期将从骨髓微环境角度阐明FGF10/FGFR2信号在BMSCs DNA损伤介导AML耐药的分子机制,为AML的靶向治疗提供新思路。研究方法：1.研究BMSCs和HUVECs DNA损伤后信号通路的改变：将HS-5和HUVECs分别暴露于化疗药物ADR、IDA和Ara-C以及NS 24小时,Western blot方法检测NF-κB、P38 MAPK、mTOR和β-catenin信号通路的改变。2.阻断BMSCs NF-κB信号通路对AML细胞生物学行为和DNA损伤分泌蛋白表达的影响。2.1NF-κB抑制剂处理HS-5细胞：应用NF-κB抑制剂Bay11-7082处理HS-5细胞1小时、3小时和6小时,Western blot方法检测NF-κB P65、p-P65、IKBa的蛋白表达,验证抑制剂效果。2.2阻断BMSCs NF-κB信号通路对AML细胞药物敏感性和凋亡的影响：分别应用Bay11-7082、Bay 11-7082联合ADR处理HS-5后的条件培养基培养AML细胞,并给予一定浓度的ADR处理72小时,CCK8方法和Annexin V/PI染色后流式细胞术检测AML细胞相对存活率和凋亡率的改变。2.3阻断BMSCs NF-κB信号通路对DNA损伤分泌蛋白表达的影响：Bayll-7082处理HS-5细胞6小时后,给予ADR、IDA和Ara-C处理24小时,Real-time RT-PCR方法检测IL-6、IL-8、Activin A、CYR61、6Ckine、FGF10、EG-VEGF和GH基因的mRNA表达。3. BMSCs DNA损伤后β-catenin通路对FGF10表达的调控机制研究：将HS-5细胞暴露于不同浓度的β-catenin激活剂(LiCl)24小时,细胞免疫荧光、Westernblot和Real-time RT-PCR方法检测β-catenin及其下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、 CD44、Trib2)和FGF10的表达。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表达水平的检测。4.1 Real-time RT-PCR方法检测FGFR1、FGFR2、FGFR3在AML细胞中的mRNA表达。4.2 FGFRs在AML患者和正常对照骨髓中的表达：收集144例AML患者和34例正常对照骨髓标本,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,Real-time RT-PCR方法检测FGFR1、FGFR2、FGFR3的mRNA表达。4.3 BMSCs DNA损伤后条件培养基对AML细胞中FGFRs表达的影响：应用IDA和NS处理HS-5后的条件培养基以及RPMI1640培养基培养THP-1细胞24小时,Real-time RT-PCR方法检测FGFR1和FGFR2的mRNA表达。5.研究FGF10介导AML耐药的具体机制。5.1重组人FGF10处理AML细胞后FGFR1和FGFR2的表达改变：将THP-1和U937细胞饥饿过夜培养后,加入不同浓度的重组人FGF10处理一定时间,Western blot和Real-Time RT-PCR方法检测FGFR1、FGFR2和下游活化分子pFRS2a的表达。5.2重组人FGF10处理AML细胞后下游信号通路的改变：FGF10处理THP-1和U937细胞后,Western blot方法检测P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平。6.探讨阻断AML细胞中FGFR2表达逆转AML耐药的可能性。6.1阻断FGFR2表达对AML细胞药物敏感性的影响：应用FGFRs抑制剂BGJ398和PD173074处理THP-1和U937细胞1小时,并给予一定浓度的ADR、IDA、 Arac处理72小时,CCK8方法检测AML细胞相对存活率的改变。6.2阻断FGFR2表达对AML细胞下游信号通路的影响：应用BGJ398和PD173074处理THP-1细胞1小时,Western blot方法检测FGFR2、下游活化分子pFRS2α以及下游P38MAPK、AKT、ERK和STAT3信号通路的改变。7.下调AML细胞中FGFR2表达对AML细胞增殖和药物敏感性的影响。7.1病毒感染：应用FGFR2-ShRNA (ShFGFR2)和Control-ShRNA (ShCtrl)慢病毒感染THP-1细胞72小时,荧光显微镜下观察感染效率,应用嘌呤霉素筛选获得稳定感染细胞,Western blot和Real-time RT-PCR方法检测病毒感染稳筛后FGFR2的表达,验证转染效率。7.2 CCK8方法检测细胞增殖：CCK8方法检测转染ShFGFR2和ShCtrl慢病毒的THP-1细胞的增殖情况。7.3 CCK8方法检测细胞药物敏感性的改变：CCK8方法检测不同浓度ADR作用下转染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1细胞相对存活率的改变。8.阻断AML细胞FGFR2对抑癌基因PTEN表达的影响：收集PD173074处理后以及转染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1细胞,Western blot方法检测PTEN和pPTEN的蛋白表达。9.统计分析：应用SPSS 17.0软件处理数据,采用Student's t检验和非参数检验进行统计分析。P0.05为差异有统计学意义。研究结果：1. BMSCs和HUVECs DNA损伤后信号通路的改变：Western blot结果显示,与对照组相比,NF-κB P65和P38 MAPK在ADR、IDA或Ara-C处理后的HS-5或HUVECs中的磷酸化水平明显升高。与对照组相比,β-catenin在ADR、IDA或Ara-C药物处理后的HS-5胞浆和胞核中的蛋白表达明显升高,而mTOR的磷酸化水平未见显著改变。2.阻断BMSCs NF-κB信号通路对AML细胞生物学行为和DNA损伤分泌蛋白表达的影响：2.1 Bay11-7082对NF-κB信号通路的抑制作用：Western blot结果显示,HS-5细胞暴露于Bayll-70826小时后,NF-κBP65的磷酸化水平以及IKBa的蛋白表达显著降低。2.2阻断BMSCs NF-κB信号通路对AML细胞药物敏感性和凋亡的影响：(1)CCK8和流式细胞术结果显示,与DMSO处理HS-5后的条件培养基组相比,Bayll-7082处理HS-5后的条件培养基组中AML细胞的相对存活率明显降低,而凋亡率未见明显改变。(2)CCK8和流式细胞术结果显示,与DMSO联合ADR处理HS-5后的条件培养基组相比,Bayll-7082联合ADR处理HS-5后的条件培养基组中AML细胞的相对存活率明显降低,而凋亡率呈现升高趋势。2.3阻断BMSCs NF-κB信号通路对DNA损伤分泌蛋白表达的影响：Real-time RT-PCR结果显示,在化疗药物作用下,与DMSO组相比,IL-6、IL-8和ActivinA在Bayll-7082组中的mRNA表达明显降低,6Ckine、FGF-10、EG-VEGF和GH在Bayll-7082组中的mRNA表达明显升高,而CYR61的mRNA表达未见显著改变。3. BMSCs DNA损伤后通过β-catenin通路调控FGF10的表达：细胞免疫荧光结果显示,与对照组相比,β-catenin在LiCl处理组胞核中的蛋白表达显著升高。Western blot结果显示,与对照组相比,β-catenin及其下游靶基因c-Myc、 CyclinD1和CD44以及FGF10在LiCl处理组细胞中的蛋白水平明显升高。Real-time RT-PCR结果显示,在不同浓度LiCl作用下,HS-5细胞中c-Myc、 CyclinDl的mRNA表达未见显著改变,而Trib2和FGF10的mRNA表达呈现升高趋势。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表达水平的检测：4.1 FGFRs在AML细胞中的表达：Real-time RT-PCR结果显示,FGFR1、FGFR2和FGFR3在THP-1、U937和Kasumi-1细胞中的mRNA表达相对较高。4.2 FGFRs在AML患者和正常对照骨髓中的表达：Real-time RT-PCR结果显示,与正常对照相比,FGFR1和FGFR2在治疗后AML患者骨髓中的mRNA表达明显升高。与初诊AML患者相比,FGFR3在治疗后AML患者骨髓中的mRNA表达明显升高。4.3 BMSCs DNA损伤后条件培养基对AML细胞中FGFRs表达的影响：Real-time RT-PCR结果显示,FGFR1和FGFR2在IDA处理HS-5后的条件培养基组中的mRNA表达明显高于NS处理HS-5后的条件培养基组和RPMI 1640培养基组。5.FGF10通过活化AML细胞FGFR2并激活下游MAPK/STAT3信号通路参与AML耐药：5.1 FGF10激活AML细胞中FGFR1和FGFR2的蛋白表达：Western blot和Real-Time RT-PCR结果显示,在不同浓度FGF10作用下,THP-1和U937细胞中FGFR1、FGFR2及下游活化分子pFRS2a的蛋白表达明显升高,而]mRNA水平无明显改变。5.2 FGF10激活AML细胞中MAPK/STAT3信号通路：Western blot结果显示,在FGF10作用下,AML细胞中P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平明显升高。6.阻断AML细胞中FGFR2表达通过抑制MAPK/STAT3通路逆转AML耐药：6.1阻断FGFR2表达可增强AML细胞对化疗药物的敏感性：CCK8结果显示,THP-1和U937在BGJ398处理组和PD173074处理组中的相对存活率明显低于DMSO处理组。6.2阻断FGFR2表达可抑制下游MAPK/STAT3信号通路：Western blot结果显示,与DMSO处理组相比,BGJ398处理组中FGFR2和pFRS2a的蛋白表达明显降低；与DMSO处理组相比,BGJ398处理组中P38 MAPK和AKT的磷酸化水平显著降低,STAT3的磷酸化水平未见显著改变。与DMSO处理组相比,PD173074处理组中P38MAPK、EKR和STAT3的磷酸化水平均显著降低。7.下调AML细胞中FGFR2表达可逆转AML耐药：7.1转染效率检测：Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,与转染ShCtrl的THP-1细胞相比,转染ShFGFR2的THP-1细胞中FGFR2的mRNA和蛋白表达明显降低。7.2下调FGFR2表达可抑制AML细胞增殖：CCK8结果显示,与转染ShCtrl的THP-1细胞相比,转染ShFGFR2的THP-1细胞的增殖速率显著降低。7.3下调FGFR2表达可增强AML细胞对化疗药物的敏感性：CCK8结果显示,在不同浓度ADR作用下,与转染ShCtrl的THP-1细胞相比,转染ShFGFR2的THP-1细胞相对存活率明显降低。8.阻断AML细胞FGFR2可激活抑癌基因PTEN的表达:Western blot结果显示,与DMSO处理组相比,PD173074处理组中PTEN的磷酸化水平显著升高。与转染ShCtrl的THP-1细胞相比,转染ShFGFR2的THP-1细胞中PTEN的磷酸化水平轻微升高。结论：1. BMSCsDNA损伤后NF-κB和P38 MAPK信号通路显著活化,其中阻断NF-κB信号通路可增强AML细胞对化疗药物的敏感性并促进其凋亡,提示NF-κB信号通路在BMSCs DNA损伤介导AML耐药中发挥重要作用。2. BMSCs DNA损伤后通过β-catenin通路调控FGF10的表达,且损伤后BMSCs释放的FGF10以旁分泌形式通过激活AML细胞FGFR2/MAPK/STAT3信号通路介导AML耐药。3.阻断FGFR2表达可通过抑制MAPK/STAT3信号通路逆转AML耐药,提示靶向AML细胞受体酪氨酸激酶FGFR2/MAPK/STAT3通路有望成为抗AML耐药治疗的新策略。第三部分Th细胞在AML中的异常表达研究背景：近年来,随着对白血病发病机制的深入研究,AML患者体内免疫功能异常备受广泛学者关注。目前,免疫界学者普遍认为免疫系统功能紊乱参与AML的发病,是AML难治复发和死亡率较高的重要原因之一。T细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫与机体免疫调节中发挥重要作用,其中辅助性T细胞(Th)是机体免疫应答的重要调控者和效应者。研究表明,随着肿瘤的进展白血病细胞可抑制宿主免疫系统,这与Th细胞的功能障碍相关。然而,Th细胞免疫功能紊乱在AML发病中的具体作用机理尚未完全阐明。Th细胞是一群能够辅助T、B淋巴细胞应答的功能性T细胞。过去对Th细胞的研究主要限于经典的Thl和Th2亚群,关于白血病此类Th亚群的研究已有报道,多数学者认为AML中Th1/Th2比值降低,推测AML中存在Thl功能低下而Th2功能亢进的免疫失衡状态。然而,目前有关AML患者外周血中Th1/Th2和其他新型Th亚群的相互关系仍需进一步研究。Th17细胞是近年来发现的一群以分泌白介素17(IL-17)为主的CD4+T细胞,在慢性炎症、肿瘤和自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用。研究发现,Th17细胞及其细胞因子IL-17在初诊AML患者外周血中的比例明显升高,而在完全缓解AML患者中的比例明显降低。另有研究显示,与正常对照相比,IL-17在初诊AML患者中的水平无明显改变。由此可见,Th17细胞在AML中的作用尚存有争议,仍需进一步阐述。Th22细胞是新近发现的一群分泌IL-22、但不分泌IL-17和IFN-γ的CD4+T细胞,具有独特的基因表达和功能特性,在炎症和自身免疫性疾病中同样发挥重要作用。我们前期研究发现,Th22和IL-22在初诊AML患者骨髓中的表达明显降低,提示Th22及其细胞因子IL-22参与AML的发生发展。然而,Th22在AML患者外周血中的作用目前尚未见报道,亟待进一步研究。研究目的：本研究诣在检测AML患者外周血中Th22、Th17、纯Th17和Th1细胞的表达以及外周血上清中IL-22和IL-17的分泌情况,并分析Th细胞与IL-22和IL-17的相关性。研究AML患者外周血中转录因子RORC的表达,分析其与Th细胞的相关性,明确RORC在AML患者体内异常表达的Th细胞分化中的作用。比较分析不同类型AML患者外周血中Th细胞的表达,并评估其与AML疾病活动程度的相关性。研究方法：1.标本采集：收集AML患者外周血标本56例,包括初诊组26例,完全缓解组(CR)14例和未完全缓解组(Non-CR)16例。收集正常对照外周血标本30例。采用差速离心法分离外周血血清,密度梯度心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。2.流式细胞术法：流式细胞术检测AML患者和正常对照外周血中Th22、Th17、纯Th17和Th1细胞的比例。3.酶联免疫吸附试验(ELISA)法：ELISA方法检测AML患者和正常对照血清中IL-17和IL-22的分泌情况。4. Real-time RT-PCR方法：Real-time RT-PCR方法检测AML患者和正常对照PBMCs中RORC基因的mRNA表达。5.统计分析：应用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验比较分析AML患者和正常对照组中Th细胞、IL-17、IL-22、RORC以及不同类型AML患者中Th细胞的表达差异。应用Spearman秩相关分析Th细胞和细胞因子、Th细胞和RORC的表达以及Th细胞和AML患者临床特征的相关性。P0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.Th22细胞和IL-22在AML患者外周血和外周血血清中的表达。1.1流式细胞术结果显示,与正常对照或CR AML患者相比,Th22细胞在初诊和Non-CR AML患者中的比例明显升高,而Th22细胞在初诊和Non-CR AML患者之间的比例无明显差异。1.2 ELISA结果显示,与正常对照组相比,IL-22在初诊AML患者中的比例明显升高,IL-22在Non-CR或CR AML患者中的表达无明显改变。IL-22在初诊和Non-CR AML患者之间的表达亦无明显差异。2.Th17、纯Th17细胞和IL-17在AML患者外周血和外周血血清中的表达。(1)流式细胞术结果显示,与正常对照组相比,Th17细胞在初诊、Non-CR和CRAML患者中的水平均明显升高,而Th17细胞在CR与初诊AML患者或CR与Non-CR AML患者之间无明显差异。(2)流式细胞术结果显示,与正常对照相比,纯Th17细胞在初诊和Non-CR AML患者中的水平均明显升高。然而,纯Th17细胞在初诊和Non-CR AML患者之间的表达无明显差异。(3) ELISA结果显示,与正常对照相比,IL-17在初诊、Non-CR和CR AML患者血清中的水平明显降低。3.Th1细胞在AML患者外周血中的表达：流式细胞术结果显示,与正常对照相比,Th1细胞在初诊AML患者中的比例明显降低,在其他各组之间未见明显差异。4.AML患者外周血中Th细胞以及与细胞因子IL-22、IL-17之间的相关分析。(1) Spearman秩相关分析结果显示,在初诊AML患者中,Th22和纯Th17细胞呈明显正相关,Th22和Th1细胞呈明显负相关,而Th22和Th1细胞无显著相关性。在Non-CR患者和CR患者中,Th22、Th17、纯Th17和Th1细胞之间均无相关性。(2) Spearman秩相关分析结果显示,在初诊AML患者中,血浆IL-22浓度与纯Th17细胞呈正相关,而IL-22与Th17、Th1细胞及IL-17无明显相关性。5. RORC在AML患者PBMCs中的mRNA表达及其与Th细胞的相关分析。(1) Real-time RT-PCR结果显示,RORC在Non-CR AML患者中的mRNA表达明显高于初诊AML患者或正常对照。与正常对照相比,RORC在CR AML患者中的mRNA表达明显升高。与之相比,RORC在Non-CR、CR和初诊AML患者之间的mRNA表达无明显差异。(2) Spearman秩相关分析结果显示,在Non-CR AML患者中,RORC与Th22细胞呈正相关,RORC与纯Th17细胞接近正相关。6. Th22、Th17、纯Th17及Thl细胞与AML患者临床特征的相关分析：Spearman秩相关分析结果显示,在初诊AML患者中,Th22细胞与AML患者外周血原始细胞的比例呈显著正相关,Th1细胞与AML患者外周血原始细胞的比例呈显著负相关。7.不同类型AML患者中Th22、Th17、纯Th17和Th1细胞的表达：流式细胞术结果显示,Th22、Th17和纯Th17细胞在急性粒单核细胞白血病患者中的表达明显高于急性单核细胞白血病患者。然而,Th1细胞在不同类型AML患者中的表达未见明显差异。结论：1.AML患者外周血中存在Th22、Th17、纯Th17和Th1细胞的异常表达,Th22和纯Th17细胞显著正相关,提示Th22和纯Th17可能协同促进AML发病。2. Non-CR AML患者中RORC与Th22、纯Th17细胞呈正相关,RORC可能参与Non-CR AML患者中Th22和纯Th17细胞分化。3.初诊AML患者中Th22细胞的高表达与外周血原始细胞的增高显著正相关,提示Th22可能是评估AML患者危险程度的一个新的生物学指标。4.急性粒单核细胞白血病中存在Th22、Th17和纯Th17的异常高表达,Th细胞可能主要参与急性粒单核细胞白血病的发生发展。
【图文】：

图１．细胞免疫巧光方法检测Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化疗药物处理后的ＨＳ－５细胞中的表达逡逑

ＮＳ逦ＡＤＲ逦ＩＤＡ逦Ａｒａ－Ｃ逡逑Ｙ－Ｈ２ＡＸ－ＴＲＩＴＣ逡逑。？国WW■逡逑Ｍ。？国WW国逡逑ＨＳ－５逡逑图１．细胞免疫巧光方法检测Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化疗药物处理后的ＨＳ－５细胞中的表达逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
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本文编号：2534905