LGR5剪切体在结直肠癌中的临床意义和功能研究

发布时间：2019-09-12 07:12

【摘要】：背景:结直肠癌的发病率和死亡率在国内外均居前五,是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。结直肠癌的发生和发展是一个多基因累积、多步骤调控的病理过程。现已明确的相关调控基因包括TP53、APC、KRAS,CTAF、CTNNB等,而随着测序技术的发展,越来越多的研究表明,特定基因的剪切体也参与了肠癌发生发展的过程。基因的剪切体来源于前体mRNA的剪切,即一个前体mRNA通过不同剪切位点的组合产生不同mRNA转录本的过程。其结果导致一个基因能够最终被翻译成多种结构相似但是功能不同的蛋白产物。癌变组织中特定基因的剪切体表达谱可不同于正常组织,从而影响癌细胞的生物学行为。如CD44基因剪切体CD44v6在多种肿瘤中显著升高并参与了肿瘤的转移、侵袭等过程。此外CD44v6还与结直肠癌的预后相关。LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)属于 G 蛋白偶联受体家族成员,主要分布在消化道系统、毛囊、卵巢、子宫内膜等器官组织中。LGR5与Wnt通路高度相关,而后者又是肠癌发生发展的重要通路。LGR5在肠癌中过表达,其基因可被剪切成四种剪切体(Splicevariant,SPV),其中剪切体SPV1,SPV2和SPV3能被翻译成蛋白,SPV4为非编码mRNA,无法正常翻译为蛋白。有研究表明,LGR5剪切体SPV1-3在正常肠粘膜组织中均能被检测到,且在肠隐窝的不同组分中分布不同,提示其在肠道细胞分化生长过程中发挥着不同功能。然而,LGR5的不同剪切体在结直肠癌中的分布情况、临床意义和对肠癌发生发展的功能意义尚不明确。目的:本研究通过对LGR5剪切体SPV1-3在结直肠癌临床病例标本中丰度的检测,分析其与患者临床病理特征的相关性,明确LGR5剪切体的临床意义;之后在细胞水平探究三种剪切体对肠癌细胞增殖、迁移等生物学行为的影响并分析相关信号通路,进一步明确其影响肠癌发生发展的具体机制。方法:Ⅰ.LGR 剪切体在肠癌中的丰度和临床意义1.设计LGR5剪切体SPV1-3的特异性引物,用PCR法构建三种LGR5剪切体的真核表达质粒,用于验证引物特异性。2.从本中心冰冻样本库选取93对结直肠癌和正常粘膜配对样本,用所设计引物和RT-qPCR方法测定标本中三种剪切体的丰度,与临床病理特征进行相关性分析。Ⅱ.LR5剪切体的功能研究1.用RKO和HT29细胞系构建过表达SPV1、SPV2和SPV3的稳转细胞系。2.通过CCK8、Transwell、划痕愈合试验等方法研究LGR5剪切体对肠癌细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。3.用蛋白免疫印迹法检测LGR5剪切体过表达细胞系中EMT(epithelial mesenchymal transition)通路相关分子如E-cadherin、Vimentin等蛋白的表达水平以及Wnt通路中β-catenin和LRP6磷酸化水平,评估其对这两条通路的调控。4.以Wnt通路特异性靶基因Axin2mRNA水平为检测指标,研究不同LGR5剪切体对Wnt通路激活强度的调控。结果:Ⅰ.LGR5剪切体在肠癌中的丰度和临床意义1.LGR5剪切体SPV1、SPV2和SPV3的mRNA丰度在结直肠癌组织(n=93)中均显著高于正常组织(n=93)(SPV1:42.73±5.26 vs 24.60±3.34,P0.0001;SPV2:43.43±5.71 vs36.78±2.66,p=0.0041;SPV3:53.77±7.63 vs27.76±4.15,p=0.0009)。2.SPV1与患者的临床分期、分化程度、局部淋巴结转移和远处转移无显著相关性(p0.05)。3.SPV2丰度在低分化腺癌中显著高于中、高分化腺癌(SPV2:31.69±7.15vs 56.49±8.75,P=0.0367);在Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌中显著高于Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌(SPV2:71.72±14.26 vs 37.10±6.03,p=0.0184);与淋巴结转移和远处转移无显著相关性(P0.05)。4.SPV3在低分化腺癌中丰度明显高于中、高分化腺癌(97.84±24.69 vs 43.91±7.16,p=0.0057);在 Ⅲ、Ⅳ 期患者中显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(74.51±13.12vs 35.14±7.64,p=0.0074);并且 SPV3 在淋巴结转移(75.28±14.26 vs 39.53±7.35,p=0.0138)和远处转移(71.641±12.46vs47.37±5.98,p=0.0363)中均较无转移患者显著增高。Ⅱ.LGR5剪切体的功能研究1.LGR5剪切体在RKO和HT29中的过表达对该两种细胞的增殖无明显影响。2.SPV1和SPV2在RKO和HT29细胞中过表达后能够促进该两种细胞的迁移,而SPV3则能抑制其迁移。3.SPV1和SPV2在RKO和HT29细胞中过表达后能够促进EMT通路并强化Wnt通路的激活。而SPV3在该两种结直肠癌细胞中过表达则下调EMT通路相关分子并削弱Wnt通路的激活。结论:1.LGR 剪切体SPV1、SPV2和SPV3丰度在结直肠癌中显著高于正常肠粘膜,提示其与结直肠癌发生相关。2.SPV2和SPV3与临床病理特征的相关性方面较为相似:在低分化腺癌中显著高于中、高分化腺癌,且SPV3还与结直肠癌的局部淋巴结转移与远处转移相关;但SPV1与患者病理特征无明显相关性。因此,SPV3或许可作为反映结直肠癌患者病理分化程度和转移特性的标志分子。3.SPV1和SPV2在功能上相似且与SPV3功能相反。前者能够促进肠癌细胞的迁移,并促进EMT和Wnt通路激活,后者对该过程和通路则表现为抑制作用。因此SPV1和SPV2可能参与了结直肠癌的发生和转移。SPV3在细胞中抑制转移的功能与其在转移性肠癌中高表达的结果不一致,原因尚不清楚,需要进一步探索。
【图文】：

剪切体,结构示意图

ＬＧＲ５蛋白属于Ｇ蛋白偶联受体家族成员，由一个较长的胞外段，一个七次逡逑跨膜区和一个较短的胞内段组合而成。全长ＺＧ欠５由１８个外显子编码，共有四种逡逑剪切体（ｓｐｌｉｃｅ邋ｖａｒｉａｎｔ，邋ＳＰＹ），在此我们分别简称为邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２、ＳＰＶ３、ＳＰＶ４逡逑（困１）。其中ＳＰＶ１为全长蛋白，ＳＰＶ２缺失第２６３至２８６位氨基酸（第８外显子），逡逑ＳＰＶ３缺失第１４３至２１４位氨基酸（第５外显子），ＳＰＶ４缺失第１４３至２％位氨基逡逑酸（第５至第８外显子）。只有ＳＰＶ４因剪切后移码，导致无法正常翻译为蛋白产逡逑物，在此不纳入我们的巧究范围。由于剪切体之间缺失特定的外显子序列而其余逡逑序列相同，因此制备特异性抗体非常困难。另外，我们也没有找到商业化的ＩＧ化５逡逑剪切体特异性抗体，因此无法进行免疫印迹或免疫组化分析，而只能通过设计特逡逑异性引物，使用ｑＰＣ民对其丰度进行检测。为了能正确无误地设计特异性引物，本逡逑部分首先克隆并构建了邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２和ＳＰＶ３的质粒，，用于检测引物的正确性。逡逑随后在９３对肠癌样本中检测不同剪切体的丰度，结合样本的临床数据，探究其临逡逑床意义。逡逑ＬＧＲ５邋全长邋ＳＰＶ１逡逑

引物设计,基因克隆,方案,引物

浙江大学巧N学位论文逦第一部分实验方法逡逑例：首先Ｗ上一步获得的ＩＧ化ＳＰＶ１为模板，分别用引物ＩＧ化５Ｆ２和ＳＰＶ２１ｉｎｋｅｒ逡逑民，Ｗ及引物ＩＧｉ？５Ｒ２和ＳＰＶ２邋１ｉｎｋｅｒＦ扩增出剪切位点前后两个片段，并分别切逡逑胶回收得到ｆｒａｇｍｅｎｔｌ和ｆｒａｇｍｅｎｔ］，然后将５０ｎｇ的两种片段等物质的量比例混合逡逑作为模扳，ＷＩＧ欠５Ｆ２和ＺＧ化５民２为引物进行扩增，即获得ＺＧ化５ＳＰＶ２。同理可逡逑得逦化５ＳＰＶ３。逡逑２．２．３．１逦ＳＰＶ１－３邋引物设计逡逑ＮＣＢＩ邋Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；邋ＮＭ＿００３６６７．３逦ＢａｍＨＩ逦．逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

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