【摘要】：目前在中国,肺癌导致的死亡率已高居肿瘤病死率的首位。肺癌在组织学上分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类,其中NSCLC导致的死亡率远高于小细胞肺癌,约占80%。近年来,虽然NSCLC的诊断及治疗技术取得了巨大进展,但其5年生存率仍较低(约15%左右)。Micro RNAs是一类广泛存在于动植物体内高度保守的非编码单链RNA,只有18-25个核苷酸长度。Micro RNAs主要通过影响信使RNA(m RNA)的转录,调节基因的翻译和表达,发挥其调控作用。Micro RNAs调节m RNA的转录作用主要表现为:1.通过转录后基因沉默;2.通过抑制靶向m RNA翻译或分裂过程。近10余年来许多研究表明micro RNA在肿瘤生长、增殖和转移中发挥着重要作用;同时micro RNA在组织、血浆、粪便及其它体液中表达稳定,即使是小样本量标本也能进行定量检测,这说明micro RNA可以作为肿瘤诊断和判断预后的潜在生物学标记物。Let-7是在秀丽隐杆线虫研究中被发现的,是继lin-4之后被确立的第二个micro RNA。目前Let-7有13种家族成员已明确基因序列。有研究证实在多种肿瘤(前列腺癌、卵巢癌、肺癌等)的发生、发展和预后中,Let-7呈现低表达,而且恢复其表达后可靶向作用于多种癌基因(Ras、C-myc和HMGA2等),起到抑制肿瘤生长的作用。Let-7c是Let-7家族成员之一,位于21q11.21。多项研究认为Let-7c是一类肿瘤抑制因子,在多种人类肿瘤中表达水平下调或缺失,但关于Let-7c在NSCLC中的作用机制探讨还缺乏大样本高通量的研究。APRIL,即增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand),属肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族配体成员,编码基因位于染色体的17p13.1,发现于上世纪90年代末。APRIL在健康人组织中表达相对很弱,但在多种肿瘤组织(结肠癌、胰腺癌和胃癌)和正常免疫细胞(B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞等)中都有高丰度表达。目前已研究确认的两个主要的APRIL特异性受体为TACI(transmembrane activator and CAML interactor,人跨膜蛋白活化物及钙调亲环素配体相互作用分子)、BCMA(B-cell maturation antigen,B-细胞成熟抗原),APRIL与之结合后发挥促进肿瘤细胞的增殖、分化、转移扩散,调节体液免疫,参与B、T淋巴细胞增殖和活化等功能。有研究发现,APRIL及其受体BCMA、TACI在非小细胞肺癌中均具有较高的表达水平,同时在A549细胞中APRIL能够激活MAP激酶。这些研究结果提示,APRIL及其受体BCMA、TACI可能参与到肺癌形成及增殖的调控机制中。本研究的主要目的是通过研究mi R-Let-7c、APRIL在NSCLC肿瘤、癌旁组织及外周血中的表达情况,同时比较mi R-Let-7c、APRIL及其相应受体BCMA和TACI表达情况与NSCLC患者临床病例特征之间的关系,通过体外实验检测APRIL及其相应受体BCMA和TACI对肺癌细胞系增殖、迁移及信号转导途径的影响,以期探寻mi R-Let-7c、APRIL在NSCLC中的作用机制,并为这两者是否可作为NSCLC诊断或预后判断生物学标志物提供理论基础。第一部分Let-7c降低在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的临床意义及其诊断价值研究方法(1)采用病例对照研究,收集76名手术切除的NSCLC患者癌及癌旁组织,手术前后血浆样本和180名健康对照血浆样本。(2)采用q RT-PCR方法,检测Let-7c m RNA在NSCLC组织、癌旁组织及外周血的表达水平。(3)采用q RT-PCR方法,检测Let-7c m RNA在NSCLC患者手术前后及健康对照血浆中的表达水平。(4)检测A549和H1650细胞中let-7c表达水平,转染let-7c mimics以恢复A549和H1650细胞let-7c的表达。MTS、细胞划痕和CCK8实验评价let-7c对NSCLC细胞增殖和细胞周期的影响。(5)统计学处理:所有实验数据采用SPSS19.0进行统计处理,每组实验重复三次,取(?)±SD进行计算处理。P0.05被认为具有统计学意义。结果(1)76例NSCLC患者癌组织较癌旁组织mi R-Let-7c的表达显著下降(P0.05)。(2)组织标本中mi R-Let-7c的表达,与NSCLC患者的病理分期、分化程度及淋巴结转移相关,且有统计学意义(P0.05)。(3)与健康对照组相比,NSCLC组血浆mi R-Let-7c表达明显下调(P0.05)。(4)NSCLC患者血浆中mi R-Let-7c表达与患者淋巴结转移及分化程度有显著相关性。(5)mi R-Let-7c的诊断敏感度和特异性分别为72%和78%,血浆中mi R-Let-7c在NSCLC的诊断准确率ROC曲线分析显示,AUC面积为0.714。(6)NSCLC患者手术前血浆mi R-Let-7c表达水平较术后显著下降。(7)A549和H1650细胞中let-7c呈低表达,转染恢复A549和H1650细胞中let-7c的表达后,细胞的增殖受到抑制。第二部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者中APRIL、BCMA和TACI临床意义及其可能分子机制探讨方法(1)采用免疫组织化学方法检测76例NSCLC患者癌组织及癌旁组织中APRIL及其相关受体TACI和BCMA蛋白的表达。(2)将BCMA-TACI-sh RNA质粒瞬时转染H1299和A549细胞株,空质粒作为阴性对照,用细胞划痕法检测可溶型APRIL对H1299、A549肺癌细胞生长迁移影响。(3)采用sh RNA干扰技术敲除H1299和A549肺癌细胞系BCMA和TACI基因表达,用CCK-8方法检测sh RNA干扰后H1299和A549肺癌细胞体外培养增殖情况。(4)采用q RT-PCR方法检测NSCLC患者及正常对照组外周血中APRIL、BCMA及TACI m RNA的表达水平。(5)采用sh RNA干扰技术敲除H1299和A549肺癌细胞系BCMA和TACI基因表达,用Western blot方法检测APRIL作用于干扰后的A549和对照组细胞后,对MAP激酶ERK1/2信号磷酸化作用的影响。结果(1)免疫组化结果显示,APRIL反应活性主要定位于细胞胞浆中。76例肺癌组织中APRIL的阳性表达率为71.7%(54/76)高于癌旁正常组织的阳性表达率10.5%(8/76),且两者具有显著性差异(P0.05)。(2)免疫组化APRIL蛋白表达阳性率与NSCLC临床病理参数之间的相关性分析结果显示:APRIL蛋白的表达水平与NSCLC患者临床病理特征中的性别、年龄、组织学分类没有相关性(P0.05),但与淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分化程度存在密切相关性(P0.05)。(3)免疫组化BCMA蛋白表达阳性率在NSCLC患者中显著升高(P0.05),与临床病理参数之间的相关性显示:BCMA蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤组织学分类、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P0.05),但与淋巴结转移存在密切相关性(P0.05)。(4)免疫组化TACI蛋白表达阳性率在NSCLC患者中显著升高(P0.05),与临床病理参数之间的相关性显示:TACI蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P0.05),但与肿瘤组织学分类存在密切相关性(P0.05)。(5)可溶型APRIL蛋白能促进H1299和A549细胞的迁移,但对于BCMA和TACI基因干扰的H1299和A549细胞,APRIL蛋白并不能提高其细胞迁移能力。(6)BCMA和TACI基因表达干扰后的肺癌细胞系H1299和A549,与对照组相比,A549细胞生长24h后细胞增殖能力显著下降(P0.05);而H1299细胞则在生长48h后细胞增殖能力显著下降(P0.05)。(7)q RT-PCR结果显示:NSCLC患者外周血中APRIL m RNA的表达水平高于正常对照组,具有显著性差异(P0.05)。与临床病理特征分析结果显示:APRILm RNA表达水平与NSCLC患者年龄、性别、病理类型、癌症分期无关(P0.05),与淋巴结转移、分化程度有关(P0.05)。而APRIL相关受体TACIm RNA表达水平与淋巴结转移、分化程度有关(P0.05),BCMA m RNA表达水平则未见与NSCLC患者临床病理特征有显著相关性。(8)可溶型APRIL蛋白可使A549细胞ERK1/2的磷酸化水平升高,且显著高于正常对照组(P0.05),而对于BCMA和TACI基因表达干扰的A549细胞系,APRIL不能提高其ERK1/2的磷酸化水平。(9)外周血中mi R-Let-7c、APRIL m RNA实时定量RT-PCR联合检测,对于诊断NSCLC的敏感度为59.21%(45/76),特异性为82.22%(148/180)。结论(1)NSCLC患者肿瘤组织及外周血中mi R-Let-7c的低表达与NSCLC的发展和侵袭有密切关系。(2)外周血中mi R-Let-7c可能成为NSCLC诊断、转移及预后的生物学标记物。(3)NSCLC患者组织中APRIL及其相关受体TACI、BCMA的高表达与肿瘤的发展、浸润和转移有关。(4)APRILm RNA在NSCLC患者外周血中高表达,且与肿瘤发展、浸润相关,提示可以作为NSCLC诊断及判断预后的生物学标记物。(5)体外实验结果提示,可溶型APRIL蛋白可促进肺癌细胞增殖,可能参与NSCLC肿瘤的发生和发展,并以激活MAP激酶ERK1/2磷酸化信号转导途径来促进肿瘤细胞增殖。(6)外周血mi R-Let-7c、APRILm RNA实时定量RT-PCR联合检测将有助于提高NSCLC诊断的敏感性。
【图文】：
1 1%甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定总 RNA 的完 PCR 检测结果 U6 作为内参基因，miR-Let-7c 作为目次，从两种扩增基因的溶解曲线和扩线，曲线轨迹基本重合，说明 PCR 扩且无其它杂峰出现，说明引物并未出体和污染）；引物设计特异性良好，qR曲线(见图 2 和图 3A)如下所示；构建 稀释度阳性标准模板在同一时间进行定平滑，说明曲线构建良好(图 3B)。将检起始点，即 Ct ( Cycle threshold，阈循板的对数进行拟合作图，将不同定量模Ct 值作为纵坐标，从而得出一条定量标
图 2 U6 溶解曲线图 3 Let-7c 的标准曲线扩增曲线（A）和溶解曲线(c 在 NSCLC 组织及其对应癌旁组织中的表达-Let-7c 在 NSCLC 组织中的表达量，，我们选择A B
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：
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