miR-93在胃癌中的功能及机制研究

发布时间：2019-09-21 01:17

【摘要】：第一部分miR-93在胃正常组织、胃癌组织及胃癌细胞株中的表达及其与胃癌临床病理学学特征之间的关系目的：检测microRNA-93 (miR-93)在正常胃黏膜组织、胃癌组织及胃癌细胞株中的表达,分析其表达与胃癌临床病理学特征的相关性。方法：收集20例正常胃黏膜标本,60对配对的胃癌及癌旁标本：购买6种胃癌细胞株(AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、HTB135及MKN-74)及永生化的胃黏膜上皮细胞株GES-1。利用qRT-PCR的方法检测上述组织及细胞株中miR-93的表达水平：利用Mann-Whitney Test分析miR-93的表达水平与胃癌患者临床病理学参数之间的相关性。结果：qRT-PCR检测结果表明,与正常的胃黏膜组织及癌旁组织相比(相对表达量分别为0.462±0.031、0.864±0.056),miR-93在胃癌组织中的表达量显著升高(2.093±0.156);进一步分析表明其表达水平与肿瘤的大小、pTNM分期及淋巴结转移相关相关：miR-93在肿瘤直径大于4.5cm中的表达量(1.576±0.013)显著高于肿瘤直径小于4.5cm中的表达量(1.309±0.036)：在有淋巴结转移组织中的表达量(3.124±0.082)明显高于无淋巴结转移组织中的表达量(1.871±0.054)；晚期胃癌(Ⅲ、Ⅳ期)组织中miR-93的表达量显著高于其在正常胃黏膜组织及早期胃癌(Ⅰ、Ⅱ期)组织中的表达量,且其表达水平随胃癌的演进而升高。此外,我们在胃癌细胞株中也得到了与胃癌组织中一致的结果,即与正常的胃黏膜细胞株GES-1比较(0.957±0.029),miR-93在胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、 MKN-74、HTB135中的表达也显著升高(分别为2.053±0.081、2.353±0.137、2.792±0.186、3.051±0.115、3.126±0.227、3.611±0.194)。结论：miR-93在胃癌组织和胃癌细胞中高表达,其表达的水平与胃癌的大小、淋巴结转移及pTNM分期有关,提示胃癌组织中高表达的miR-93可能与胃癌的发生发展有关。第二部分miR-93对胃癌细胞株生物学行为的影响目的：在体外研究异常表达的miR-93对胃癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。方法：使用瞬时转染技术,将miR-93 mimics、miR-93 inhibitor转入相应的胃癌细胞株AGS与HTB135中,引起miR-93在上述细胞中的表达上调或下调,后分别采用CCK-8、流式细胞术及Transwell实验检测异常表达的miR-93对胃癌细胞的增殖能力、周期分布、凋亡及侵袭与迁移能力的影响。结果：CCK-8实验的结果表明,与阴性对照组(miR-NC)相比,AGS细胞在转染miR-93 mimics后48、72及96h的增殖能力明显增强：相反,转染miR-93 inhibitor后48、72及96h, HTB135细胞的增殖能力受到显著抑制。然而各转染组细胞的增殖能力在转染后24h无明显差异(P0.05)。流式细胞术的结果表明,转染后48h,与miR-NC组比较,过表达miR-93使AGS细胞处于G0G1期的比例显著减少,而位于S期的细胞比例明显增加;相反,当抑制miR-93的表达时,可使HTB135细胞周期阻滞于G0G1期。然而,上述处理对AGS及HTB135的凋亡功能无明显影响。Transwell实验结果表明,转染后24 h,与miR-NC组比较,转染miR-93 mimics的AGS细胞其侵袭及迁移能力显著提高;相反,转染miR-93 inhibitor的HTB135细胞其侵袭及迁移能力受到明显抑制。结论：体外功能学实验表明miR-93的表达可促进胃癌细胞的增殖,侵袭及迁移能力,提示miR-93在胃癌的发生发展中可能发挥促癌基因的功能。第三部分miR-93调控胃癌细胞生物学行为的机制探讨目的：预测并验证miR-93在胃癌细胞中的靶基因,进一步阐明miR-93在胃癌中具体发挥促癌功能的分子学机制。方法：使用在线生物学信息软件TargetScan与MiRbase预测miR-93的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验对靶基因进行验证。后使用Western blot和靶基因沉默实验进一步明确miR-93通过对靶基因P21与PTEN的负调控而在胃癌细胞中发挥促癌功能。结果：生物信息学软件预测P21及PTEN是miR-93的靶基因；双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-93可显著抑制野生型pGL3-P21-WT及pGL3-PTEN-WT的荧光素酶活性,而对其对突变体pGL3-P21-Mut及pGL3-PTEN-Mut的荧光素酶活性无显著影响；Western blot结果进一步表明,miR-93可负调控P21及PTEN的表达；此外,靶基因沉默实验结果显示,抑制P21及PTEN的表达可促进胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。结论：miR-93是通过(至少是部分通过)调控其靶基因P21及PTEN的表达而在胃癌细胞中发挥促癌功能,这或许为miR介导的胃癌靶向治疗提供新的实验依据及理论基础。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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本文编号：2539114