LKB1调控肺腺癌辐射敏感性及机制的实验研究

发布时间：2019-09-27 20:46

【摘要】：目前在世界范围内,肺癌已经上升成为第一位高发的恶性肿瘤,发病率和死亡率呈逐年上升趋势,但其5年生存率一直徘徊在15%～20%左右,疗效亟待提高。放射治疗作为肺癌主要的治疗手段之一,在肺癌的综合治疗中占据重要地位,如何提高肺癌的辐射敏感性一直是肿瘤研究领域的热点问题。肝激酶B1 (liver kinase B1,LKB1)基因属于钙/钙调蛋白激酶样家族,据文献报道,大约有33%的原发性肺腺癌患者和50%的肺腺癌细胞株存在LKB1基因突变。目前研究认为,LKB1基因通过多个信号通路对肺癌的发生、发展和转移等都起着重要作用,这些信号通路往往与p53和p21等肿瘤抑制因子发生相互关联,而p53和p21等都是辐射敏感相关因素。因此,我们提出LKB1对肺癌细胞可能具有辐射增敏作用的设想,并在前期构建融合过表达质粒pEGFP-LKB1在体外转染LKB1缺失突变的A549、H460肺腺癌细胞株,进行了初步探索,结果显示LKB1过表达能增加肺癌细胞的辐射敏感性,其机制可能与其抑制细胞增殖、减少照射后亚致死性损伤的修复和促进细胞周期再分布等方面有关。在前期工作基础上,为进一步探讨LKB1对肺腺癌的辐射增敏作用及其可能的机制,本研究构建、筛选了携带增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent portein, EGFP)标记的LKB1小干扰融合质粒,以LKB1正常表达的人肺腺癌细胞株H1299和95-D为研究对象,观察下调LKB1对肺腺癌细胞生物学行为及辐射敏感性的影响,并探讨其可能的机制；另外,利用LKB1缺失突变的人肺腺癌细胞株H460构建裸鼠肺癌皮下移植瘤模型,过表达LKB1并联合照射,观测肿瘤抑制情况,在体内水平探讨LKB1过表达对肺腺癌细胞辐射敏感性的影响。肿瘤放射治疗后残留的肿瘤细胞——即肿瘤辐射抗性细胞,其侵袭力和转移活性增强,是肿瘤复发和转移的主要来源。有研究显示肿瘤辐射抗性细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)现象的发生和上调是肿瘤侵袭转移的关键因素。我们的前期实验表明,过表达LKB1后的肺腺癌A549和H460细胞,迁移能力变弱,提示LKB1可能有抑制肺腺癌细胞浸润和侵袭的作用。但LKB1是否能够通过调控EMT来影响肺腺癌辐射抗性细胞浸润侵袭及其可能的机制尚不十分清楚。前期我们针对LKB1缺失的肺腺癌A549构建辐射抗性细胞株,并转染LKB1过表达质粒,结果显示上调LKB1可抑制肺腺癌辐射抗性细胞EMT,减弱其侵袭迁移能力。为进一步探讨LKB1对肺腺癌辐射抗性细胞EMT及迁移侵袭的调控作用,在前期工作基础上,本研究构建了LKB1正常表达的肺腺癌H1299辐射抗性细胞株,检测其生物学特性；并下调LKB1,检测细胞侵袭迁移能力的变化,观察EMT标志蛋白的改变,并监测LKB1下游效应分子SIK1和ZEB1蛋白水平的变化,探索LKB1基因对肺腺癌辐射抗性细胞EMT是否有调控作用及其可能的机制。本研究对提高肺癌细胞辐射敏感性有一定的现实意义和应用前景,为提高肺癌治疗疗效初步奠定理论和实验基础。本研究分两部分进行。第一部分：LKB1对肺腺癌辐射增敏作用的研究：第二部分：LKB1调控肺腺癌辐射抗性细胞上皮间质转化的研究。第一部分：L1KB1对肺腺癌辐射增敏作用的研究目的：在体外,采用shRNA技术观察下调LKB1对肺腺癌细胞生物学行为的影响及辐射增敏作用；构建裸鼠肺腺癌移植瘤模型,探讨LKB1在体情况下对肺腺癌辐射敏感性的影响。方法：构建LKB1小干扰融合质粒并鉴定,在体外转染人肺腺癌H1299和95-D细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光表达, Western blot检测LKB1蛋白的表达水平。CCK-8法、流式细胞术和划痕实验等方法检测下调LKB1基因对肺腺癌细胞增殖、细胞周期分布、侵袭能力等生物学行为的影响。根据单击多靶模型和线性二次模型,集落形成实验绘制细胞存活曲线,计算D 0、Dq、α/β和辐射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER)等放射生物学指标,检测LKB1的辐射增敏作用；联合射线照射,CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术测定细胞周期分布以及Wentern blot检测γ-H2AX、p-Chk2、p53口p21蛋白表达,探讨LKB1可能的辐射增敏机制。构建裸鼠肺腺癌H460皮下移植瘤模型,将荷瘤鼠随机分为空载质粒对照(pEGFP-Ctrl)组、过表达LKB1 (pEGFP-LKB1)组、照射+空载质粒(IR+pEGFP-Ctrl)组和照射+过表达LKB1 (IR+pEGFP-LKB1)组共四组,结合射线照射,观察肿瘤生长情况,分析其放射敏感性的差异；并对肿瘤标本进行HE染色,免疫组化染色和Western迹法检测瘤组织LKB 1表达情况。结果：通过酶切鉴定和测序,证明融合质粒成功构建。在转染LKB1小干扰融合质粒后12、24、48、72 h,分别荧光显微镜下观察发现,24 h时绿色荧光蛋白表达最多；Western blot结果显示转染24 h后,LKB1为干扰最佳。CCK-8法检测显示,下调LKB1后H1299和95-D细胞增殖活性增强(P0.05)；流式细胞术显示,下调LKB1后H1299和95-D细胞G0/G1期和G2/M期细胞比例明显减少,而S期细胞比例升高,差异具有统计学意义(P0.05)；划痕实验检测显示,下调LKB1后H1299和95-D细胞迁移能力增强(P0.05)。集落形成实验显示,下调LKB1后H1299和95-D肺癌细胞集落形成率增高,Do和Dq增大,“p值变小,SER分别为0.809和0.735。联合射线照射,CCK-8法检测显示,同一剂量照射下,干扰LKB1组的细胞存活率较对照组明显增高(P0.05),照射剂量为8 Gy时差异最大；流式细胞术结果显示,下调LKB1联合照射后处于G0/G1期和G2/M期的细胞比例明显减少,而S期细胞比例升高(P0.05),以8 Gy最为明显：Wentern blot检测结果显示,下调LKB1联合照射后γ-H2AX、p-Chk2和p21蛋白表达减低(P0.05),H1299细胞未检测到p53蛋白表达,95-D细胞p53蛋白表达减低(P0.05)。体内实验显示,pEGFP-LKB1组、IR+pEGFP-Ctrl组和IR+pEGFP-L B1组三组肿瘤生长都受到不同程度的抑制,IR+pEGFP-LKB1组瘤体积和瘤体重量均为最低,肿瘤生长最为缓慢,过表达LKB1与射线具有协同抑制肿瘤生长的作用(P0.05)；免疫组化染色和Western印迹法结果显示pEGFP-LKB1组和IR+pEGFP-LKB1组瘤组织LKB1表达,其余两组无LKB1表达。结论：(1) LKB1具有一定的抑癌作用,在体外干扰LKB1可以调控肺腺癌细胞增殖、周期分布和迁移能力。(2)LKB1可能具有辐射增敏作用,在体外干扰LKB1可以调控肺腺癌细胞的辐射敏感性；LKB1有可能通过调控p53及p21信号进而影响肺腺癌细胞辐射敏感性。(3)在体内过表达LKB1有抑制裸鼠肺腺癌移植瘤生长的作用,并能够增强其对辐射的敏感性。第二部分：LKB1调控肺腺癌辐射抗性细胞上皮间质转化的研究目的：在体外构建H1299肺腺癌辐射抗性细胞株,检测其增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学特性；干扰LKB1表达后,检测细胞侵袭迁移能力改变以及LKB1、SIK1、 ZEB1、E-cadherin 和 Vimentin等蛋白表达的改变。方法：小剂量等分割照射法、亚致死量照射法和梯度递增照射法优化H1299肺腺癌辐射抗性细胞构建方案,倒置相差显微镜观察细胞形态,根据单击多靶模型和线性二次模型,集落形成实验绘制细胞存活曲线,计算D0、Dq和α/β等放射生物学指标,CCK-8法检测肺腺癌辐射抗性细胞受照射后的增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡,’Transwell实验检测侵袭和迁移能力,划痕实验检测迁移能力,Western印迹法检测EMT标志蛋白E-cadherin和Vimentin表达,Western印迹法检测LKB1、SIK1 和ZEB1蛋白水平。在体外,LKB1小干扰质粒转染H1299肺腺癌辐射抗性细胞,Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力,Western印迹法检测LKB1、SIK1、ZEB1、 E-cadherin 和 Vimentin蛋白水平。结果：梯度递增照射法所得到的肺腺癌辐射细胞抗性较强,将其命名为H1299R,倒置相差显微镜下见细胞体积变大,细胞间距离增大,细胞的极性消失,向纺锤样间质细胞形态改变,其Do和Dq值增高,α/β比值降低,CCK-8法检测结果显示增殖能力增强(P0.05),流式细胞术检测发现细胞凋亡减少(P0.05),Transwell和划痕实验显示细胞侵袭迁移能力增强(P值均0.05)；Western印迹法检测结果显示E-cadherin表达量下调,LKB1、SIK1蛋白水平降低,Vimentin及ZEB1蛋白水平增高(P值均0.05)。在体外,下调H1299R细胞LKB1后,Transwell实验和划痕实验检测显示侵袭和迁移能力增强(P值均0.05),Western印迹法检测显示LKB1、SIK1和E-cadherin蛋白水平降低(P值均0.05),ZEB1 和 Vimentin蛋白表达水平升高(P值均0.05)。结论：(1)可采用梯度递增照射法构建肺腺癌辐射抗性细胞；肺腺癌辐射抗性细胞具有增殖活性增强,受照后细胞凋亡减少,EMT上调,侵袭迁移能力增强等生物学特点。(2)下调LKB1可以使肺腺癌辐射抗性细胞EMT表型增强,侵袭和迁移能力增加,LKB1可能通过下游SIK1/ZEB1信号通路发挥其调控作用。
【图文】：

逦山东大学博ｉ；学位论义逦逡逑附图表逡逑１２邋ｈ逦＾逦４８ｈ逦７２ｈ逡逑ｉＭＨＩＷＭ逡逑■■■逡逑图ｌ－ｌ转染后不同时间肺癌细胞绿色英光蛋白表达情况（ｘｉｏｏ）逡逑注：Ｈ１２９９和９５－Ｄ细胞，分别在转染１２、２４、４８、７２邋ｈ后，，

本文编号：2542872