ECM1对肝细胞癌侵袭转移的影响及其与EMT调控机制的研究

发布时间：2019-10-01 21:47

【摘要】：【目的】1、采用免疫组织化学染色方法检测细胞外基质蛋白1(extracellular matrix protein 1,ECM1)在正常肝组织和肝癌组织中的表达情况,分析ECM1表达水平与肝癌临床病理特征及生存预后间的关系,及其与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)有关标志物(Vimentin和E-cadherin)的相关性,初步探讨ECM1在肝癌侵袭转移过程中可能发挥的作用。2、将ECM1基因稳定转染至肝癌细胞株Bel-7402中,为深入探讨ECM1在肝癌发生进展中的作用提供实验基础。3、研究稳定转染ECM1基因后对肝癌细胞株Bel-7402侵袭、转移能力的影响,并探讨其与EMT间的关系。4、探索ECM1促进肝癌Bel-7402细胞EMT可能的分子机制。【方法】1、77例肝细胞癌蜡块存档标本随机选择自安徽省立医院普外科2008至2012年间的手术切除标本,作3μm厚连续石蜡切片,分别做ECM1、Vimentin和E-cadherin免疫组化染色,分析其表达水平与肝癌临床病理指标及预后间的关系。2、根据Gen Bank数据库提供的ECM1基因序列,首先构建其真核表达载体p EGFP-N2-ECM1,经基因测序鉴定后,在脂质体介导下稳定转染人肝癌细胞株Bel-7402。3、采用RT-PCR、Western blot、划痕试验及Transwell等方法,利用构建的稳定表达ECM1基因的肝癌细胞株Bel-7402,分别观察靶细胞形态学的改变及EMT相关标志物(Vimentin和E-cadherin)m RNA和蛋白表达水平的变化,以及转染前后靶细胞侵袭转移能力的改变,探讨ECM1转染能否通过调控肝癌细胞发生EMT,从而促进肝癌的侵袭转移。4、为明确TGF-β-Smad通路在肝癌细胞Bel-7402发生EMT中的作用,用SB431542阻断TGF-β-Smad通路,检测阻断前后肝癌细胞间质性标志物Vimentin和上皮性标志物E-cadherin蛋白水平的变化及肿瘤细胞侵袭迁移能力的变化。【结果】1、77例肝癌组织标本中,共有57例不同程度的表达ECM1,且在肝癌标本中的阳性表达率(57/77)较正常肝脏组织(4/17)明显升高。在肝癌组织标本中,Vimentin的表达阳性率为61.0%,E-cadherin表达阳性率46.8%,表达缺失率为53.2%。统计学分析表明,ECM1的阳性表达率与肝癌的TNM分级和血管侵犯相关,间质性标志物Vimentin的阳性表达率及E-cadherin的表达缺失率与肝癌的临床分期显著相关,并且在肝癌组织中ECM1的表达阳性率与Vimentin呈正相关,与E-cadherin无明显相关性。2、成功构建了ECM1的真核表达载体p EGFP-N2-ECM1,通过基因测序鉴定后,在脂质体的介导下将其转染至人肝癌细胞株Bel-7402中,用G418筛选后扩大培养所获得的阳性克隆细胞。通过荧光显微镜、细胞免疫化学染色、RT-PCR和Western blot分别鉴定筛选阳性细胞,获得稳定高表达ECM1的ECM1/Bel-7402细胞模型。3、通过形态学观察表明ECM1转染Bel-7402细胞株后发生了与EMT相一致的形态学改变,细胞由成团生长、类圆形的形态向离散式生长、梭形形态的转变;与未转染组相比较,转染组Vimentin的m RNA和蛋白表达水平明显上调,而E-cadherin的m RNA和蛋白表达水平明显下调。细胞体外迁移能力试验(划痕试验)和侵袭试验(Transwell小室法)结果表明,增强转染ECM1基因在Bel-7402细胞中的表达后,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力较未转染组明显增强。4、用SB431542处理后的ECM1/Bel-7402细胞,肿瘤细胞上皮样形态发生转变;其p-Smad表达水平较对照组明显降低,说明SB431542阻断了ECM1对TGF-β-Smad通路的活化,且Vimentin的蛋白表达水平明显下降,E-cadherin的蛋白表达水平明显上升,这些结果提示TGF-β1是ECM1诱导Bel-7402细胞发生EMT过程中关键的信号通路。为了进一步评估SB431542阻滞剂对肿瘤细胞侵袭力的影响,采用Transwell试验发现,经SB431542处理后,ECM1/Bel-7402组迁移的细胞数较对照组明显减少,提示SB431542阻断TGF-β-Smad信号转导通路后抑制了肿瘤细胞的侵袭能力,进一步说明通过阻断TGF-β-Smad转导通路阻断了ECM1的信号通路,使肿瘤细胞发生EMT表型的逆转,阻碍了肿瘤的迁移和侵袭过程。【结论】1、免疫组化染色结果表明在肝癌组织中ECM1的表达阳性率较正常肝组织明显升高,且与肝癌TNM分级和血管浸润相关,可作为肝癌患者术后转移复发独立的预测指标;肝癌组织中间质性标志物Vimentin的阳性表达率与ECM1的表达水平呈正相关。2、肝癌细胞株Bel-7402在稳定转染表达ECM1基因后,肿瘤细胞在外观形态和相关分子表达水平上发生了与EMT一致的表型及功能变化,并且细胞的迁移能力和侵袭能力都明显增强。3、ECM1可能通过TGF-β-Smad信号转导通路诱导肝癌细胞Bel-7402发生EMT,TGF-β1作为该信号的关键环节可能是干预肝癌侵袭转移新的有效靶点。
【图文】：

PCR鉴定,图片,重组质粒

图 1：扩增的ECM1；M菌落的PCR鉴定结果，，图片中可见一条与预 5）。鉴定 M：Maker；1-7：挑鉴定切重组质粒后用1％琼 627 bp)，表明ECM1基

质粒,PCR鉴定,图片,重组质粒

Marker；2：EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】