酸性微环境诱导肺癌细胞自噬及其分子机制

发布时间：2019-10-01 22:39

【摘要】：背景:众所周知,肿瘤细胞的长期生存依赖于周边的低氧酸性微环境,肿瘤酸性微环境对肿瘤的增殖、浸润及转移均发挥了重要作用。而正常细胞却无法耐受这种胞外酸性胞内中性至碱性的特殊环境,推测肿瘤细胞之所以能在酸性环境下生存,一定有其自身的适应机制。自噬在清除有害物质、维持细胞稳态方面起着重要作用。酸性微环境能否诱导肺癌细胞自噬活化,以及自噬功能和具体作用机制,目前尚不清楚。目的:研究肿瘤赖以生存的酸性微环境对肺癌细胞自噬的影响及自噬所发挥的作用,探讨酸诱导自噬的分子机制,从而为理解酸性微环境对肺癌细胞生存、增殖的影响,为肿瘤在酸性微环境下生存提供了理论支持,另外,通过对自噬活化的信号通路的研究有助于我们找到有效的抗肿瘤治疗方法。方法:(1)明确酸性刺激诱导肺癌细胞自噬将A549和NCI-H226细胞株暴露于不同酸度的培养基,设定不同的培养时间,用western blot检测自噬相关蛋白表达情况,进一步通过电镜、荧光显微镜观察酸性条件下肺癌细胞内自噬小体的变化情况;通过用western blot法检测p62蛋白及细胞在自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf)作用下LC3 II的表达情况判断自噬流的存在。(2)明确酸性刺激诱导肺癌细胞自噬的功能分别运用自噬抑制剂3-ma、baf及rna干扰方法抑制自噬后,用流式细胞仪检测酸性环境下肺癌细胞凋亡水平的变化情况,westernblot法评估凋亡相关蛋白的表达。通过利用a549细胞建立裸鼠肺癌皮下瘤模型,用碳酸氢钠干预肿瘤酸性微环境后,通过测量肿瘤的体积、重量,westernblot检测自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达,判断抑制自噬对肺癌细胞凋亡的影响。(3)明确酸性刺激诱导肺癌细胞自噬的作用机制不同酸浓度的培养基处理肺癌细胞后,westernblot检测内质网应激相关重要信号分子及p-ampk、p-akt、p-mtor各分子的表达情况;用流式细胞仪检测不同酸刺激后肺癌细胞内活性氧(ros)的变化情况;通过用ros抑制剂干预细胞后,westernblot检测内质网应激相关信号分子的表达情况;通过用grp78sirna抑制内质网应激后,westernblot检测酸性条件下肺癌细胞表达自噬相关蛋白及p-ampk、p-mtor的变化情况。用compoundc抑制ampk后,westernblot检测lc3ii的表达水平。结果:(1)酸性微环境诱导肺癌细胞发生自噬,并在一定范围内呈浓度-时间依赖性使用培养基(ph:6.6、6.9、7.4)分别培养a549和nci-h226细胞后,lc3ii和beclin1蛋白表达明显上调,且以ph6.6培养基中细胞内lc3ii、beclin1蛋白表达量最高,相反,p62蛋白表达呈下降趋势。透射电镜观察酸刺激下细胞内可见典型双层膜的泡状结构,即自噬小体形成。通过转染gfp-lc3质粒,在荧光显微镜下观察到肺癌细胞内点状荧光较对照组明显增多;暴露细胞于ph6.6培养基中分别作用12、24、48、72h后,lc3ii、beclin1蛋白表达呈时间依赖性。利用baf抑制自噬后,再给予细胞酸刺激,免疫荧光法发现点状荧光聚集较对照组明显增多,lc3ii蛋白表达也支持上述实验结果。(2)酸诱导体内外肺癌细胞自噬具有保护作用分别用3-ma、baf抑制自噬后,再给予a549细胞酸处理,用流式细胞仪检测细胞凋亡发现,酸联合3-ma处理组细胞凋亡率为(35±3.25)%,酸联合baf处理组细胞凋亡率为(37±4.26)%。下调自噬相关基因beclin1抑制自噬后,首先用cck-8法证实细胞活性较对照组明显降低,进一步用流式细胞仪检测发现细胞凋亡率在酸联合beclin1sirna组明显升高,cleavedcaspase3和cleavedparp表达也相应增强。裸鼠皮下瘤模型表明碳酸氢钠组较对照组,肿瘤体积缩小,肿块重量减轻,p62及cleavedcaspase3蛋白表达增强,细胞凋亡数明显增多,提示酸诱导自噬使肺癌细胞免受凋亡。(3)明确酸性刺激下,自噬活化的分子机制不同酸性培养基作用于肺癌细胞后,p-perk、p-eif2a、grp78、xbp-1s、atf6和p-ampk蛋白表达均明显增强,p-mtor表达减弱,p-akt表达无明显变化,ros水平较对照组明显升高,通过用抗氧化剂nac干预后,grp78、p-eif2a及lc3ii表达均减少,提示内质网应激的变化情况与ros呈正相关,进一步用grp78sirna抑制内质网应激后,p-AMPK表达减弱,p-mTOR表达增强,LC3 II含量降低,细胞免疫荧光法检测发现点状绿色荧光颗粒明显减少。通过Compound C抑制AMPK以阻断信号通路AMPK-mTOR后,LC3 II表达明显减少。结论:(1)酸性刺激可诱导肺癌细胞自噬活化。(2)肺癌细胞自噬活化可以使其免受凋亡。(3)酸性条件下肺癌细胞内产生过多的ROS导致内质网应激,并顺序激活AMPK-mTOR通路,诱导自噬产生,提示ROS-ERS信号通路参与自噬的活化。
【图文】：

荧光显微,小体,肺癌细胞,酸处理

酸性培养基联不联 Baf 处理肺癌细胞 24h 后，，利用细胞免疫荧光技检测肺癌细胞内噬小体变化情况。本实验设 control 组、Baf 组、酸处理组酸+Baf 组。#p<0.05 与单纯酸处理组比较。By pretreatment with Baf associated, lung cancer cells were cultured for 24h in acidic or normmedium, autophagysomes were detected by immunocytochemistry.图 1-3-1. Baf 干预后，荧光显微下观察胞内噬小体情况

学位论文,医科大学,博士研究生,重庆

-1.细胞检测肺癌细胞凋亡情况
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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