抑癌基因Mig-6在食管鳞状细胞癌中的作用及机制研究

发布时间：2019-10-02 00:18

【摘要】：背景和目的:食管癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一,根据2012年国际癌症研究机构(IARC)的统计数据显示,每年在全世界范围内新发的食管癌病例高达45.58万,标化发病率约为5.90/10万,在人类全部恶性肿瘤发病中位居第8位;每年因为食管癌死亡的患者病例高达40.02万,标化死亡率约为5.00/10万,在人类全部恶性肿瘤中位居第6位,严重威胁着人类的生命和健康[1-3]。食管癌发病呈明显的地域分布特征,我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一,据我国癌症中心的统计数据结果显示:在2012年我国食管癌的发病率为21.17/10万,在我国全部恶性肿瘤中位居第5位,死亡率为15.58/10万,在全部恶性肿瘤中位居第4位[4,5]。与病理类型多为腺癌的欧美西方国家不同,我国食管癌病理类型90%以上为食管鳞状细胞癌。目前食管癌的病因尚未完全明确,临床上多采取手术治疗为主,放、化疗及其他治疗方法为辅的综合治疗方案。但是由于食管癌发病早期的症状不明显以及缺乏简单、可靠的早期诊断技术,高达70%的食管癌患者就诊时病程己经处于中、晚期;即使已行手术治疗的患者,由于缺乏术后特异性、敏感性高的监测指标,恶性肿瘤局部复发、远处转移等的发生严重影响了患者的生活质量和预后;另外目前国内外研究尚未发现针对食管癌敏感的治疗靶点及相对应的靶向治疗药物[6-8]。综合以上各种原因,食管癌总体治疗效果远未达到令人满意,食管癌5年平均生存率仅为30-40%。因此立足本国食管癌的发病特点,加强食管癌的理论研究,寻找敏感性、特异性高的检测指标、治疗靶点及相对应的靶向药物,意义重大。有丝分裂诱导基因6(Mitogen induced gene 6,Mig-6)是新近发现的肿瘤抑制基因,在乳腺癌、子宫内膜癌、肝细胞癌,非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌、脑胶质瘤、甲状腺癌等多种人类常见恶性肿瘤中均观察到了Mig-6基因的表达缺失和蛋白质的表达下降;Mig-6基因敲除的小鼠容易罹患如肺、胆囊、胆管、子宫、胃肠道等多个器官、组织的恶性肿瘤[9-12]。体外实验发现Mig-6可抑制肿瘤细胞的生长增殖、侵袭和转移,引发肿瘤细胞的凋亡。而有关Mig-6与食管鳞状细胞癌的关系国内外文献未见报道,Mig-6在食管鳞状细胞癌中是否起到抑癌作用、若存在抑癌作用其作用机制值得进一步研究。本实验研究在人食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常食管组织中应用应用实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)及免疫组织化学染色的实验方法分别检测Mig-6基因及蛋白的表达,统计学分析其表达与患者临床病理参数的相关性;Real-time PCR的实验方法在人食管鳞状细胞癌细胞株TE13、EC109、KYSE510中筛选出Mig-6基因m RNA相对低表达的细胞株,通过脂质体转染的方法上调Mig-6基因的表达,观察人食管鳞癌细胞株生长增殖和凋亡水平的改变;应用脂质体转染联合基因芯片的技术检测Mig-6基因表达上调后食管鳞癌细胞基因表达谱的改变情况,筛选与Mig-6相互作用的上、下游基因及可能参与的信号通路,初步探讨Mig-6基因在食管鳞癌中发挥抑癌作用的可能机制。方法:1、应用Real-time PCR的实验方法检测人的食管鳞状细胞癌组织以及相应的癌旁正常食管组织(距离肿瘤边缘≥5cm)中Mig-6基因m RNA的表达;免疫组化的实验方法检测食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常食管组织中Mig-6蛋白的表达,若存在食管鳞状细胞癌组织中Mig-6的表达下降,统计学分析其与性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期及肿瘤分化程度等临床病理参数之间的关系。2、常规培养人食管鳞状细胞癌细胞株TE13、EC109、KYSE510,采用Real-time PCR的实验方法对Mig-6基因在3株食管鳞癌细胞中的m RNA的表达水平进行检测,筛选出Mig-6基因m RNA相对低表达的人食管鳞癌细胞株TE13。3、常规培养人食管鳞癌细胞株TE13,传代后细胞分为2组:实验组转染含Mig-6的真核表达质粒pc DNA3.1(+)/Mig-6,对照组转染空白真核表达质粒pc DNA3.1(+)。采用Real-time PCR和Western Blotting的实验方法验证转染效率,确认转染成功。分别在转染后24、48和72小时应用MTT实验来检测两组细胞的生长增殖情况,绘制细胞的生长曲线,计算细胞的生长抑制率;转染48小时后进行流式细胞学检测,观察食管鳞癌细胞凋亡水平的改变。4、常规培养人食管鳞癌细胞株TE13,脂质体转染的方法上调Mig-6基因的表达,转染成功以后,应用Agilent人类全基因表达谱基因芯片筛选差异基因(差异倍数foldchange≥2或≤0.5),然后对筛选出的差异基因进行综合分析,初步探讨Mig-6基因可能的抑癌作用机制。结果:1、食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常食管组织相比Mig-6基因m RNA表达水平相对较低(1.00VS1.67±0.16),差异有统计学意义(t=22.627,P=0.000);免疫组化结果显示,在食管鳞状细胞癌组织中Mig-6蛋白的表达阳性率显著低于癌旁正常食管组织,差异有统计学意义(x~2=21.679,P=0.000)。统计学分析发现Mig-6的表达和患者性别(x~2=0.859,P=0.354),年龄(x~2=0.892,P=0.741)、肿瘤部位(x~2=0.647,P=0.732)无关;和肿瘤TNM分期(x~2=4.21,P=0.04)和分化程度(x~2=8.438,P=0.004)相关。2、Real-time PCR的实验方法检测3种食管鳞癌细胞株TE13、EC109、KYSE510中Mig-6基因m RNA的表达水平,TE13与其余2株食管鳞癌细胞相比Mig-6基因m RNA表达水平相对较低(1.00VS6.77±1.17VS133.59±5.44),差异有统计学意义(F=3262.019,P=0.000),选取TE13作为下步转染实验的理想细胞株。3、脂质体转染的方法上调食管鳞癌细胞株TE13中Mig-6基因的表达,Real-time PCR和Western Blotting的实验方法确认转染成功,MTT检测结果显示细胞的生长增殖受到抑制,随着时间延长,细胞生长抑制变得明显(F=11.051,P=0.001,);流式细胞学检测的结果显示细胞的凋亡率升高(22.44±3.69VS35.84±5.98),差异有统计学意义(t=4.669,P=0.001)。4、脂质体转染的方法上调Mig-6基因的表达后,人食管鳞癌细胞株TE13基因表达谱发生广泛改变:确定表达差异基因2212个,其中表达上调的基因1141个,表达下调的基因1071个,主要涉及信号通路有MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、细胞因子与受体间相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)通路等。结论:1、在食管鳞状细胞癌组织中存在Mig-6基因m RNA及蛋白表达水平下降,与食管鳞状细胞癌TNM分期及肿瘤分化程度相关,Mig-6有可能成为食管鳞状细胞癌的不良预后因子。2、脂质体转染的方法上调食管鳞癌细胞株TE13中Mig-6基因的表达,应用Real-time PCR以及Western Blotting的实验方法确认转染成功后,食管癌细胞的生长增殖受到抑制,细胞的凋亡增加。3、转染Mig-6基因后引起食管鳞状细胞癌细胞株TEl3基因表达谱的广泛变化,Mig-6基因可能通过与其相互作用的上、下游基因以及相关的如MAPK信号通路、细胞因子与受体间相互作用通路、细胞粘附分子通路等发挥抑制食管鳞状细胞癌的作用,为后续的机制研究提供了方向。
【图文】：

曲线,基因扩增,目的,曲线

博士学位论文一、Mig-6 在食管鳞癌中的表达及其与临床病e PCR 反应，目的 Mig-6 基因及内参 GAPDH 基因的扩 1.1-1.4 所示：目的基因和内参的扩增曲线斜率一致性良无脱尾，说明提取的 RNA 无基因组 DNA 污染，引物设聚体，Real-time PCR 反应结果可反应目的基因的表达。

溶解曲线,基因,目的,内参

博士学位论文一、Mig-6 在食管鳞癌中的表达及其与临床病e PCR 反应，目的 Mig-6 基因及内参 GAPDH 基因的扩 1.1-1.4 所示：目的基因和内参的扩增曲线斜率一致性良无脱尾，说明提取的 RNA 无基因组 DNA 污染，引物设聚体，Real-time PCR 反应结果可反应目的基因的表达。图 1.1：Real-time PCR 反应目的 Mig-6 基因扩增曲线
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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