CYP2W1对胃癌细胞增殖及与预后的关系研究
发布时间：2019-10-02 01:56
【摘要】：胃癌(gastric cancer, GC)为最常见的恶性肿瘤之一,为消化道肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤。全世界每年胃癌新发病例数约为100万,约占整个恶性肿瘤新发病例总数的8%,位居第4位。每年约有70多万人死于胃癌,死亡率位居第2位,无性别差异。我国每年胃癌新发病例占全世界新发病例数的42%,发病率、死亡率为全球平均水平2倍,为胃癌发病率和死亡率最高的国家之一。早期胃癌在我国筛查率低,仅为10%左右,患者就诊时多为进展期胃癌(advanced gastriccarcinoma,AGC)。日本早期胃癌患者中无症状者占47.6%,不确定的消化道症状者占31.2%,有消化性溃疡样症状者仅占17.9%。而我国早期胃癌患者中91.3%的是因为不确定消化道症状而就诊,无症状患者仅为2.72%。目前在我国,胃癌的临床现状具有“三低三高”的特点,所谓“三低”即早期诊断率低(≤10%)、手术切除率低(≤70%)、5年生存率低(40%左右)；“三高”即发病率高,且有年轻化趋势、术后复发转移率高、死亡率高。胃癌的发生、发展是一个多因素、多步骤、进行性发展的过程,原因目前尚不完全清楚,牵涉多方面作用机制。对于胃癌患者的预后,日本国立癌症中心对胃癌术后资料进行多因素分析后得出结论：影响胃癌患者预后的因素主要为肿瘤的浸润深度,其次为淋巴结转移情况,另外尚与远处转移、肿瘤组织类型、肿瘤大小等有关。胃癌发生浸润及转移是一个多步骤、多阶段、多个基因参与受多因素调控的连续的复杂的主动过程,因此,对于胃癌发生浸润和转移的基因及分子标记物的研究对胃癌的早期诊断、治疗、预后评定具有重要的临床意义。CYP2W1为细胞色素P450超家族新型成员之一,研究表明,该酶在胎儿结肠内源性表达,出生后由于甲基化而沉寂,仅仅在胎鼠结肠及多种人体肿瘤组织中表达。CYP2W1高表达于胃肠道肿瘤,尤其高表达于结肠癌和直肠癌。CYP2W1基因片段最早在肝癌细胞系HepG2的cDNA文库中被发现,人类CYP2W1基因位于染色体7p22.3上,基因全长包含1473个核苷酸,9个外显子,编码490个氨基酸。CYP2W1在外源性及内源性物质代谢及肿瘤发生发展中的具体作用尚不完全清楚,但已有研究表明CYP2W1表达具有肿瘤特异性,在结肠肿瘤和肾上腺肿瘤尤为明显,与患者的预后相关,为结肠癌独立的预后指标,引起了研究者们的广泛关注。关于胃癌中CYP2W1的表达及其与胃癌发生、浸润、转移及预后等关系的研究,迄今尚未见国内外报道。Ki-67是较为肯定的与细胞周期相关的核增殖标志物,仅仅存在于增殖细胞的细胞核内,所编码的基因位于第10号染色体上,其表达随细胞周期的进展而增加,细胞分裂周期中,GO期不表达,G1后期开始表达,S和G2逐渐升高,M期达到高峰,细胞分裂结束后迅速降解消失,为反应细胞增殖活性的重要指标,广泛用于肿瘤细胞的增殖评估。研究表明,Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中均有过表达,并且与肿瘤的发生发展、浸润转移及预后相关。Ki-67在肿瘤组织中表达程度,对于评价肿瘤细胞的增殖活性,研究肿瘤的生物学行为及预后具有重要意义。研究Ki-67在胃癌组织中的表达,对评估胃癌细胞的增殖活性及判定预后具有重要意义。本研究首先采用免疫组织化学技术(S-P技术)检测胃癌组织及相对应的正常胃粘膜组织中CYP2W1和Ki-67蛋白表达情况,分析比较CYP2W1和Ki-67蛋白的表达与胃癌临床病理学参数之间的关系；分析CYP2W1和Ki-67蛋白表达的相关性。采用半定量RT-PCR实验和Western blot实验检测胃癌组织中CYP2W1和Ki-67 mRNA和蛋白的表达情况；分析CYP2W1和Ki-67与胃癌预后关系。在胃癌及正常胃粘膜细胞系中,应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测各组细胞系中CYP2W1的表达量,分析其相关性。选取CYP2W1表达量相对较高的胃癌细胞系为研究对象,进行细胞的分选与纯度鉴定。应用MTT实验方法,绘制生长曲线图,并应用平板克隆实验进一步研究CYP2W1表达对胃癌细胞体外增殖生长能力的影响。采用划痕愈合实验和Transwell小室实验,研究CYP2W1表达对胃癌细胞体外运动迁移侵及袭能力的影响。总之,本实验以CYP2W1为分子靶点,探讨其在胃癌细胞增殖及与预后中的作用,共分为两个部分。第一部分：CYP2W1在胃癌组织中的表达及其预后分析方法1.采用免疫组织化学技术,检测326例胃腺癌组织及相应326例正常胃粘膜组织中CYP2W1和Ki-67蛋白的表达情况,分析比较CYP2W1、Ki-67的表达及其与胃癌临床病理学参数之间的关系；2.采用半定量RT-PCR实验及Western blot实验检测随机选取10例胃腺癌组织和相对应的正常胃粘膜组织中CYP2W1和Ki-67 mRNA和蛋白的表达情况,进一步验证免疫组织化学技术的实验结果；3.做出Kaplan-Meier生存曲线,分析CYP2W1和Ki-67蛋白的表达与胃癌患者生存时间的关系,采用Spearson Correlation分析CYP2W1和Ki-67的相关性；4.采用SPSS17.0软件对实验数据均进行统计处理。免疫组化结果应用X2检验进行统计学处理,采用Kaplan-Meier存活曲线分析CYP2W1和Ki-67蛋白表达与胃癌患者预后之间的关系,并用COX比例风险模型分析CYP2W1是否为胃癌患者预后较差的独立危险因素。采用Spearson Correlation分析CYP2W1和Ki-67表达的相关性。其他数据应用单因素方差分析。P0.05为差异具有统计学意义。结果1.CYP2W1蛋白主要定位于胃癌组织的癌细胞胞浆,正常胃粘膜组织中基本不表达；胃癌组织中CYP2W1蛋白和mRNA明显高于正常胃粘膜组织(P0.05)。2. CYP2W1的表达与胃癌患者的性别、年龄、分化程度无明显相关性(P0.05)。但与胃癌患者的TNM分期及淋巴结转移密切相关(P0.05)。3. CYP2W1高水平表达的胃癌患者的生存率显著低于CYP2W1低水平表达的胃癌患者,CYP2W1的表达与胃癌患者的预后密切相关。COX比例风险模型结果表明,CYP2W1为胃癌患者预后较差的独立危险因素。4.相关性分析结果显示,CYP2W1和Ki-67在胃癌组织中的表达具有显著的相关性(P0.05)。第二部分：CYP2W1表达上调对胃癌细胞生物学行为的影响方法1.选取4组胃癌细胞及正常胃粘膜细胞系,应用实时荧光定量PCR和Western blot方法,检测各组细胞系中CYP2W1 mRNA及蛋白的表达量。2.采用MTT实验方法,绘制CYP2W1阳性胃癌细胞的生长曲线,并且利用平板克隆形成实验,观察单个胃癌细胞的成瘤能力的改变。3.应用Transwell小室侵袭实验及划痕愈合实验,研究CYP2W1表达对胃癌细胞体外迁移侵袭能力的影响。4.统计学处理：采用SPSS 17.0软件对实验数据均进行统计处理。以x±s表示数据,两组统计数据之间的统计分析应用t检验,三组及以三组以上统计数据应用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果1.实时荧光定量PCR和Western blot结果显示：4组胃癌细胞系(BGC-823、 SGC-7901、MKN-28、MGC-803)中CYP2W1 mRNA和蛋白的表达量均明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1),4组胃癌细胞系中,BGC-823细胞系中CYP2W1 mRNA和蛋白的表达量又明显高于SGC-7901、MKN-28和MGC-803细胞系,差异具有统计学意义(P0.05)。2.MTT生长曲线、平板克隆实验结果显示：CYP2W1阳性胃癌细胞生长能力明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1)；CYP2W1阳性胃癌细胞的克隆形成的数量明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1),差异具有统计学意义(P0.05)。3. Transwell小室侵袭实验结果显示：24小时CYP2W1阳性胃癌细胞侵袭穿过Transwell小室基质胶的细胞数量明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1)侵袭穿过Transwell小室基质胶的细胞数量,二者比较差异具有统计学意义(P0.05)。4.划痕愈合实验结果显示：划痕后24小时/48小时CYP2W1阳性胃癌细胞划痕修复速率明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1), CYP2W1阳性胃癌细胞划痕愈合面积明显高于正常胃粘膜细胞(GES-1),二者比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.CYP2W1仅在胃癌组织中表达,在正常胃粘膜组织中不表达；CYP2W1的表达与胃癌患者的性别、年龄、分化程度无明显相关性,但与胃癌患者的TNM分期及淋巴结转移密切相关。2. CYP2W1与Ki-67在胃癌中表达呈正相关；CYP2W1的表达与胃癌患者的预后密切相关,CYP2W1为胃癌患者预后较差的独立危险因素。3.CYP2W1与胃癌细胞的生长增殖能力及运动迁移侵袭能力明显相关。4. CYP2W1的高表达可能在胃癌的发生、发展中发挥重要作用,可能成为一种新型的肿瘤治疗的药物靶点,为胃癌的靶向治疗提供新的思路。
【图文】：
图１－１胃癌巧织与正常胃粘腺组织中ＣＹＰ２Ｗ１表达（４０0ｘ）逡逑
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本文编号：2544692
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图１－１胃癌巧织与正常胃粘腺组织中ＣＹＰ２Ｗ１表达（４０0ｘ）逡逑
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