【摘要】：目的:肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,绝大多数肝癌患者有肝纤维化和肝硬化病史,肝纤维化晚期发展成肝硬化,其中相当一部分肝硬化最终发展为肝癌。二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)是一种强烈的化学致癌剂,对肝脏有着明显的亲和力,整个诱癌过程大致经历了肝炎、肝纤维化-硬化至肝癌形成,与人类肝癌的发生过程十分相似。本实验采用间断口服DEN,构建大鼠诱发性肝癌模型。上皮细胞间质化(epithelial mesenchymal transition,EMT)指上皮细胞转化为具有间质细胞表型的动态生物学过程,主要特征以上皮细胞标记物(E-cadherin等)表达下降,同时间质细胞标记物(vimentin等)的过度表达等,其在胚胎发育、炎症、器官纤维化及肿瘤发生过程中具有重要作用。Micro RNA(miRNA)作为新型基因调节剂,它在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用,同时有研究发现miRNA可以调节EMT。miR-122在肝脏发育过程中呈持续性表达状态,一旦表达出现异常可能引起一系列肝脏疾病。研究表明,miR-122表达下调参与肝癌的发生,提示其可能起到抑癌基因样作用。观察大鼠肝细胞恶性转化过程中miR-122的表达变化,通过分析miR-122与TGF-β1、E-cadherin的相关性,探讨miR-122在肝细胞恶性转化过程的意义。方法:1.动物来源:体重180~200g,清洁级雄性SD大鼠。2.肝癌模型建立:55只大鼠按照随机化原则,选择40只作为实验组,15只作为对照组。实验组自由饮用0.01%DEN溶液6周,停药2周,期间正常饮水,继续喂药6周后停止用药,接着正常饮水2周。对照组自由饮水。3.在处理后第4、8、12及16周末称得两组大鼠体重及肝脏质量,计算肝脏指数。观察肝脏大体形态及病理学变化。4.采用q RT-PCR技术,检测两组大鼠肝组织miR-122及TGF-β1在基因转录水平的表达差异。5.采用western-blot技术,检测两组大鼠肝组织TGF-β1与E-cadherin在蛋白水平的表达差异。6.数据统计分析:应用SPSS17.0统计软件对各数据进行统计学分析。结果:1.实验组大鼠第4周末表现为肝脏炎症;第8周末表现为肝脏纤维化-硬化;第12周末表现为肝细胞不典型增生;第16周末形成肝细胞癌。实验组大鼠16周末成癌率达100%(15/15),总体死亡率为17.5%(7/40)。对照组无死亡。2.实验过程中,对照组大鼠体重变化呈直线上升,实验组体重增长缓慢,且各周期大鼠体重明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。实验组大鼠各个时期的肝脏指数高于对照组大鼠,差异有统计学意义(P0.05)。3.q RT-PCR显示实验组大鼠肝细胞miR-122呈逐渐下降趋势,各周期与对照组有显著差异(P0.05);第4周与第8周实验组大鼠肝组织中的miR-122比较,差异无统计学意义(P=0.1090.05)。实验组TGF-β1m RNA表达呈逐渐上升趋势,第4周实验组与对照组大鼠TGF-β1m RNA比较无统计学意义(P=0.1780.05)。其余各周期与对照组有显著差异(P0.05);第4周与第8周实验组大鼠TGF-β1m RNA比较,差异无统计学意义(P=0.2330.05)。4.western-blot显示实验组大鼠肝细胞恶性转化过程中,TGF-β1蛋白表达呈逐渐上升趋势,第4周实验组大鼠与对照组比较无统计学意义(P=0.0540.05)。其余各周期与对照组有显著差异(P0.05);第4周与第8周实验组大鼠肝组织TGF-β1蛋白比较,差异无统计学意义(P=0.1550.05)。实验组E-cadherin蛋白的表达量呈逐渐下降趋势,第4周与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.3100.05)。其余各个周期实验组大鼠与对照组有显著差异(P0.05)。5.Pearson相关性分析显示,miR-122与TGF-β1m RNA表达呈负相关(r=㧟0.842,P0.001),与E-cadherin蛋白表达呈正相关(r=0.808,P0.001);TGF-β1与E-cadherin蛋白表达呈负相关(r=㧟0.820,P0.001)。结论:1.采用口服DEN建立诱发性肝癌模型是一种操作简单、诱癌率高及死亡率低的造模方式。2.大鼠肝细胞恶性转化过程中miR-122表达逐渐下降,提示miR-122与肝癌发生发展可能有着密切关系。3.miR-122可能通过TGF-β1调节EMT过程,从而对肝癌的发生发展起到抑制作用。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7
【参考文献】
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2544733
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