【摘要】：目的:通过对乳腺癌及癌旁正常组织标本的实验研究,探讨micro RNA-338-3p与组织分级及肿瘤TNM分期的相关性,并在乳腺癌细胞及正常人乳腺上皮细胞中进行验证。在此基础上利用正常人乳腺上皮细胞、多种乳腺肿瘤细胞系及裸鼠分别进行实验,并通过软件进行靶标基因预测,探讨micro RNA-338-3p发挥乳腺癌抑制作用的机制,从而为乳腺癌的治疗提供新的策略和方向。方法:未接受放化疗的乳腺癌术中癌组织及周围正常组织(3cm)进行总RNA抽提,逆转录合成c DNA,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transeription PCR,q RT-PCR)进行micro RNA-338-3p表达检测,差异性表达结果与组织分级、肿瘤TNM分期、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移情况等进行相关性分析。然后分别以正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453作为研究对象,通过q RT-PCR手段明确各细胞系中micro RNA-338-3p表达情况,进一步验证micro RNA-338-3p与乳腺癌的关系。随后,通过瞬时转染micro RNA-338-3p模拟物(mimics),并设立空白对照(mi R-NC),经q RT-PCR及Western Blot验证评估,明确转染效率后,分别行MTT试验、集落形成实验、细胞周期和凋亡实验、细胞划痕实验和侵袭实验,探讨micro RNA-338-3p调控乳腺癌的作用特点和机制。鉴于已获得的micro RNA-338-3p与乳腺癌相关性的初步研究结果,利用开放的生物信息平台Targetscan6.2及mi Randa进行micro RNA-338-3p在乳腺癌细胞调控网络中的下游靶标基因的预测,结合基因已有的生物学特点,获取目标基因sox4为研究对象,探讨micro RNA-338-3p与靶标基因的调控关系。以乳腺癌细胞系MDA-MB-231为研究对象,构建双荧光素霉报告载体WT-3'-UTR SOX4-p GL3、MT-3'-UTR-SOX4-p GL3质粒,对mi R-338-3p组和mi R-NC组分别进行转染,通过q RT-PCR和western blot进行验证并评价micro RNA-338-3p对目标基因sox4表达调控的特点。利用Si RNA目标SOX4(si-SOX4)和负对照(si-NC)对乳腺癌细胞MDA-MB-231分别进行转染,并对SOX4表达、乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭、细胞凋亡和细胞周期进行评价,探讨SOX4沉默对乳腺癌细胞的影响。利用mi R-NC、mi R-338-3p模拟物,空载体(p CDNA3.0Vector)以及过表达SOX4(p CDNA3-SOX4)质粒对乳腺癌细胞MDA-MB-231分别进行转染,并对SOX4表达、乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭、细胞凋亡和细胞周期进行评价,探讨过表达SOX4与mi R-388-3p的直接作用关系。采用micro RNA-338-3p模拟物及mi R-NC转染预处理的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行裸鼠的成瘤实验。成瘤期间每周对瘤体变化情况进行记录。5周后,处死小鼠,获取组织标本,分别对mi R-338-3p组,正常组织及空白对照组mi R-NC在成瘤大小和速度,mi R-338-3p的m RNA水平,SOX4蛋白的表达情况等进行统计学分析,最终得出了micro RNA-338-3通过调控SOX4发挥乳腺癌的抑制作用的研究结论。结果:micro RNA-338-3p抑制乳腺癌组织和细胞系。前期留取未接受放化疗的乳腺癌患者的癌组织及癌症旁3cm组织,通过q RT-PCR进行micro RNA-338-3p的表达检测。来自于临床的32例样本,以均值(0.45±0.04)为界,分为高表达组(n=17)和低表达组(n=15),比对与组织分级、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移及年龄等相关性。在12例组织分级为进展期乳腺癌(stage III)患者中,9例出现了micro RNA-338-3p的低表达(75%);20例组织分级为早期乳腺癌(stages I and II)患者中,仅6例存在micro RNA-338-3p的低表达(30%)。在13例伴有淋巴转移的乳腺癌患者中,10例表现为micro RNA-338-3p低表达(76.9%);19例无淋巴转移的乳腺癌患者中,仅5例表现为micro RNA-338-3p低表达(26.3%)。但并未观察到临床样本中micro RNA-338-3p的水平与年龄、肿瘤大小、病理分期等存在相关性。与正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A对比,micro RNA-338-3p在乳腺癌细胞系(MCF-7*、MDA-MB-453*、MDA-MB-231**、BT-549**)中表达明显下降(*P0.05;**P0.01),其中以乳腺癌细胞MDA-MB-231中micro RNA-338-3p表达量最低。因此,选取MDA-MB-231细胞为研究对象进行micro RNA-338-3p模拟物瞬时转染,并设空白对照组(mi R-NC)。q RT-PCR及western blot分析显示,与mi R-NC组相比,实验组可明显下调micro RNA-338-3p表达水平。MTT实验显示,与对照组mi R-NC相比,过表达的mi R-338-3p明显抑制细胞的增殖,其中48h时P0.05,72h时P0.01。集落形成实验显示,实验组细胞集落数较对照组数量减少,P0.01。划痕实验结果显示,转染micro RNA-338-3p模拟物后24h,可见mi R-NC组细胞迁移速度快于MDA-MB-231细胞实验组,P0.01。细胞侵袭实验显示,转染micro RNA-338-3p模拟物后,MDA-MB-231细胞的侵袭能力下降,穿过基底膜的细胞数量较空白对照组mi R-NC明显减少,P0.01。与mi R-NC相比,转染了micro RNA-338-3p模拟物的乳腺癌细胞处于G1期的比例增多(P0.01),S期比例下降(P0.05),并且可明显诱导乳腺癌细胞凋亡。鉴于已获得的micro RNA-338-3p与乳腺癌的相关性,利用开放的生物信息平台Targetscan6.2及mi Randa进行micro RNA-338-3p在乳腺癌调控网络中的下游靶基因预测,结合基因已有生物学特点推测sox4基因可能为micro RNA-338-3p在乳腺癌调控过程中的下游靶基因。分别构建双荧光素霉报告载体WT-3'-UTR SOX4-p GL3以及Mut-3'-UTR-SOX4-p GL3质粒,分别与micro RNA-338-3p模拟物(mimics)或mi R-NC,对MDA-MB-231细胞进行共转染。转染后,应用流式细胞仪进行检测,结果显示,乳腺癌细胞在转染mi R-338-3p模拟物后,WT-3'-UTR-SOX4报告载体的活性被抑制(P0.01),但对MT-3'-UTR-SOX4报告载体没有抑制作用,提示mi R-338-3p对SOX4 m RNA的3’-UTR端具有直接调节作用。对转染后各分组细胞进行q RT-PCR分析,评价SOX4 m RNA表达量情况,结果显示,与空白对照组相比,实验组SOX4 m RNA表达量明显下降,P0.01,具有统计学意义。对转染后各组细胞进行western blot分析,评价SOX4蛋白表达量情况,以GAPDH为内参,结果显示,实验组SOX4 m RNA表达量明显下降,P0.01,具有统计学意义。western blot对SOX4蛋白表达的分析也得出了相同的结论。对已获得的有关SOX4及mi R-338-3p数据进行Spearman相关分析,r=-0.6431,P0.001,得出了二者负相关的结论。通过转染si-SOX4和si-NC,对各组细胞进行q RT-PCR分析,评价mi R-338-3p m RNA表达量情况,结果显示,实验组si-SOX4中mi R-338-3pm RNA表达量明显下降,P0.01,具有统计学意义。western blot分析,评价SOX4蛋白表达量情况,结果显示,实验组si-SOX4中SOX4表达量明显下降。取转染后各组24h、48h及72h为观察点,进行MMT实验,可见si-SOX4组细胞增殖下降,其中48h时P0.05,72h时P0.01,结果显示具有统计学意义。集落形成实验显示,实验组细胞集落数较对照组数量减少,P0.01,具有统计学意义。流式细胞仪结果显示,与si-NC组相比,实验组si-SOX4的乳腺癌细胞处于G1期的比例增多(P0.01),S期比例下降(P0.05)。与si-NC组相比,实验组si-SOX4的乳腺癌细胞凋亡增多,P0.01,具有统计学意义。划痕实验结果显示,转染si-SOX4后24h,可见si-SOX4组细胞迁移速度较对照组速度减慢,P0.01,结果显示具有统计学意义。细胞侵袭实验显示,转染si-SOX4后,MDA-MB-231细胞的侵袭能力下降,穿过基底膜的细胞数量较si-NC组减少,P0.01,结果显示具有统计学意义。设立mi R-338-3p+SOX4组、mi R-338-3p+Vector组及mi R-NC+Vector组,分别进行相应转染,结果显示mi R-338-3p+Vector组中SOX4 m RNA表达量明显下降(P0.01),SOX4蛋白表达量明显下降。MMT实验可见mi R-338-3p+Vector组细胞增殖下降,其中72h时P0.05,结果显示具有统计学意义。集落形成实验显示,mi R-338-3p+Vector组细胞集落数较mi R-338-3p+SOX4组数量减少(P0.01)。细胞周期和凋亡检测提示,mi R-338-3p+Vector组的乳腺癌细胞处于G1期的比例增多(P0.05),乳腺癌细胞凋亡比例增多(P0.05)。划痕实验结果显示,mi R-338-3p+Vector组细胞迁移速度较mi R-338-3p+SOX4组速度减慢(P0.05)。细胞侵袭实验显示,mi R-338-3p+Vector组MDA-MB-231细胞的侵袭能力下降,穿过基底膜的细胞数mi R-338-3p+SOX4组减少,P0.01,结果显示具有统计学意义。利用mi R-338-3p模拟物和mi R-NC预处理的MDA-MB-231细胞对裸鼠进行成瘤实验。5周后,处死小鼠,并获取组织标本。对成瘤期间每周瘤体变化进行线性比较,与mi R-338-3p组相比,可观察到mi R-NC组瘤体生长迅速,mi R-NC组瘤体较实验组大,P0.01,具有统计学意义。对癌组织中的SOX4进行q RT-PCR和western blot分析,结果提示,mi R-338-3p组较mi R-NC组表达明显降低,P0.01,具有统计学意义。结论:乳腺癌是最常见的实体恶性肿瘤之一,也是女性癌症相关死亡的主要原因。尽管手术技术、诊断方法和新的化疗方案的逐步改进显著降低乳腺癌相关死亡率,然而仍有近一半的乳腺癌患者在接受化疗和/或激素治疗后,出现远处转移。因此,对乳腺癌的发生发展及转移的分子机制研究迫在眉睫。在近几年的研究中显示,小分子核糖核酸(micro RNA,mi RNA)已成为乳腺癌治疗中较有前途的治疗靶点。本研究通过对乳腺癌组织及正常组织、乳腺癌细胞系及裸鼠等进行一系列体外体内实验,我们得到了mi RNA-338-3p作为小分子糖核酸的一种,与乳腺癌的恶性程度肿瘤TNM分期成负相关性,可在乳腺癌细胞增殖、侵袭转移及凋亡上发挥调控作用的结论,并通过靶基因预测和进一步的实验明确了其通过介导调节下游靶基因sox4而发挥乳腺癌抑制作用的结论,从而为乳腺癌的治疗提供新的策略和方向。
【图文】：
明显下降（P<0.05：MCF-7、MDA-MB-453；P<0.01：MDA-MB-231、BT-549），，以 MDA-MB-231 中 microRNA-338-3p 表达量最低。（图 2-1B）
miR-338-3p过表达抑制乳腺癌细胞的增殖和集落形成Figure3-1.OverexpressionofmiR-338-3pinhibitedtheproliferationandcolonyformationofbreastcancercells.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2545550
