miR-200c和miR-141在胃癌中表达、功能及其调节机制的研究

发布时间：2019-10-09 15:42

【摘要】：胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一,发病率位居恶性肿瘤发病率第四位,且具有很高的致死率。我国的胃癌死亡病例占全球胃癌死亡总数的40%。胃癌患者的预后不良,即使是经根治性切除手术治疗联合化学治疗的胃癌患者其五年生存率仅为35-40%。这一结果可能是由胃癌的异质性和非个体临床治疗导致的。相较于传统的肿瘤治疗方法,肿瘤靶向治疗将肿瘤的治疗带入一个崭新的阶段,研究探寻新的并且有效的肿瘤生物靶点成为近年来国际上肿瘤靶向治疗的热点之一。micro RNAs(mi RNAs)是一种长度在21-25nt的单链非编码RNA,通过与靶基因3′非编码区(untranslate dregions,UTR)的相互结合降解靶基因m RNA或是抑制靶基因m RNA的表达,发挥转录后调控的作用。mi RNAs能够调节大约30%m RNAs,具有强大的生物学功能。近年来大量研究发现,mi RNAs在肿瘤的发生发展过程中发挥着极其重要的作用。因此,mi RNAs极有可能成为肿瘤靶向治疗的靶点之一。mi R-200家族根据种子区域核苷酸序列不同分成mi R-200a,-200b,-200c,-141和-429五个成员,他们成簇表达,转录为两个多顺反子的原始mi RNA转录物mi R-200b-200a-429和mi R-200c-141,分别位于人第1(1p36.33)和12(12p13.31)常染色体上。mi R-200家族在多种肿瘤中的表达存在异常,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。但是已有研究结果表明,在不同的组织中mi R-200家族的表达、功能及其调控机制存在差异甚至相反。mi R-200家族至今未被作为重要的生物治疗靶点在胃癌中进行深入研究,其家族成员在胃癌中的表达、功能和调节机制依然不是很清楚。本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测mi R-200家族五个成员在胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中的表达,同时检测胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和胃上皮细胞株GES-1中mi R-200c和mi R-141的表达,深入分析mi R-200c和mi R-141的表达水平与胃癌患者临床病理特征、无病生存期(disease-free survival,DFS)及肿瘤标记物CA50、CEA、CA199和CA724的关系。单独或同时进行mi R-200c和mi R-141的过表达或沉默,并通过CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)实验、划痕实验和Transwell实验研究mi R-200c和mi R-141对胃癌细胞株SGC-7901增殖和侵袭、转移能力的影响,利用双荧光素酶报告基因分析检测mi R-200c和mi R-141对其预测靶基因E盒结合锌指蛋白-1、-2(zinc finger E-box-binding homeobox 1/2,ZEB1/2)的靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot检测胃癌细胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141对其预测靶基因ZEB1/2及ZEB1/2的抑制基因E-cadherin的影响。同时检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中mi R-200c和mi R-141预测靶基因ZEB1和ZEB2的表达情况,分析其与mi R-200c和mi R-141表达水平的关系。利用亚硫酸氢盐转换-甲基化特异性聚合酶链反应(Bisulfite conversion-specific and methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和q RT-PCR技术检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中mi R-200c/141簇上游Cp G岛的甲基化水平及TGF-β的表达情况,分析其与mi R-200c和mi R-141表达水平的关系。采用q RT-PCR技术检测TGF-β和去甲基化抗肿瘤药物地西他滨(5-aza-2′-deoxycytidine,5-Ad C)对mi R-200c和mi R-141在胃癌细胞株SGC-7901中表达的影响。主要研究内容和结果如下:第一部分mi R-200家族在胃癌组织和细胞系中的表达及其与临床病理特征和DFS的关系目的:通过检测mi R-200家族在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达,以及在四种胃癌细胞系和一种正常胃上皮细胞系中的表达,探讨其在胃癌中的表达情况及其与胃癌患者临床病理特征及DFS的关系。方法:采用q RT-PCR技术检测mi R-200家族在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达,检测mi R-200c和mi R-141在四种胃癌细胞系和一种正常胃上皮细胞系中的表达情况。回顾性分析其表达水平与胃癌患者的临床病理特征及DFS的相关性。胃癌患者的临床病理特征包括患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤TNM分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移情况、肿瘤远处转移情况、脉管瘤栓情况。另外,分析了mi R-200c和mi R-141表达与胃癌患者肿瘤标记物CA50、CEA、CA199和CA724表达水平的相关性。结果1 mi RNA-200家族在胃癌组织和配对的癌旁非癌组织中的表达水平。64例胃癌标本中,mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141和mi R-429的表达下调率分别是53.13%(34/64),48.44%(31/64),78.13%(50/64),76.19(48/63,1例数据丢失)和50.00%(32/64)。与配对癌旁非癌组织相比,mi R-200c和mi R-141在胃癌组织中的表达显著降低(P0.001,P0.001),mi R-200a,mi R-200b和mi R-429的表达没有显著差异(P=0.258,P=0.501,P=0.870)。另外,mi R-200c和mi R-141的表达存在正相关关系(r=0.840,P0.001)。2 mi R-200c和mi R-141在胃癌细胞系及正常胃上皮细胞系中的表达情况。与正常胃上皮细胞GES-1相比,mi R-200c在胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表达显著降低(P=0.003,P=0.003,P=0.002,P=0.008);mi R-141在胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表达亦显著降低(P=0.001,P=0.002,P=0.001,P0.001)。3胃癌组织中mi R-200c和mi R-141的表达与胃癌患者临床病理特征的相关性。63例胃癌患者中,mi R-200c的表达水平与肿瘤TNM分期、肿瘤侵袭深度、肿瘤远处转移情况及脉管瘤栓情况存在显著相关性(P=0.021,P=0.008,P=0.001,P=0.050),与患者性别、年龄、组织学分级、淋巴结转移情况没有显著相关性(P=0.062,P=0.906,P=0.218,P=0.139)。采用多元线性回归(multiple linear regression)的方法综合分析肿瘤TNM分期、肿瘤侵袭深度、肿瘤远处转移情况及脉管瘤栓对mi R-200c表达的影响,发现肿瘤TNM分期、肿瘤侵润深度与脉管瘤栓与mi R-200c的表达存在显著负相关关系(Beta=-0.424,-0.219,-0.453;t=-2.687,-1.398,-3.003;P=0.004,0.009,0.001)。mi R-141的表达水平与肿瘤侵袭深度存在显著相关性(P=0.004),与患者性别、年龄、组织学分级、肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤远处转移情况、脉管瘤栓情况没有显著相关性(P=0.937,P=0.444,P=0.373,P=0.160,P=0.172,P=0.057,P=0.630)。另外,mi R-141的表达水平与外周血中CA-724的水平呈负相关关系(r=-0.258,P=0.047)。4胃癌组织中mi R-200c和mi R-141的表达与胃癌患者DFS的相关性。63例胃癌患者中,mi R-200c高表达组与低表达的中位DFS为22.0(月)和13.5(月),mi R-141高表达组与低表达的中位DFS为21.3(月)和13.5(月)。mi R-200c和mi R-141的表达水平与患者DFS呈负相关关系(P=0.002和P=0.012)。结论1 mi R-200c和mi R-141在胃癌组织中的表达显著低于配对癌旁非癌组织,而其他mi R-200家族成员没有显著变化中。与正常胃上皮细胞GES-1相比,mi R-200c和mi R-141的表达在4株胃癌细胞株也显著降低。提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的发生发展过程中发挥着重要作用。2胃癌组织中mi R-200c和mi R-141表达与肿瘤侵润深度与脉管瘤栓情况存在显著负相关关系,提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的侵袭转移方面发挥重要作用。3 mi R-200c和mi R-141可能成为胃癌预后的潜在提示指标。第二部分mi R-200c和mi R-141对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制目的:探讨mi R-200c和mi R-141在胃癌中的功能及其发挥功能的机制。方法:单独或共同转染mi R-200c和mi R-141模拟物或是抑制物或是阴性对照,通过CCK-8、细胞划痕实验和细胞侵袭实验观察mi R-200c和mi R-141在胃癌细胞SGC-7901增殖、侵袭和转移中发挥的作用。运用Micro RNA生物信息学网站和软件,对其可能的作用靶序列进行预测分析,结合mi R-200c和mi R-141在胃癌细胞中发挥的生物学功能,进行进一步筛选。通过双荧光素酶报告基因分析的方法检测对其预测靶基因靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot检测胃癌细胞株SGC-7901中mi R-200c/141簇对其预测靶基因的影响。同时检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中mi R-200c/141预测靶基因的表达情况,分析其与mi R-200c和mi R-141表达水平的关系。结果1 mi R-200c或(和)mi R-141对胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖能力的影响。CCK-8细胞增殖实验检测结果显示,转染SGC-7901细胞48小时后,All Stars Negative Control si RNA转染组(阴性对照组)、mi R-200c mimic转染组、mi R-200c Inhibitor转染组、mi R-141mimic转染组、mi R-141Inhibitor转染组、,mi R-200c/141 mimic转染组和mi R-200c/141 Inhibitor转染组与空白对照组相比差异无统计学意义(P=0.859,0.057,0.103,0.100,0.094,0.072,0.141)。mi R-200c和mi R-141对人胃癌细胞株SGC-7901细胞的增殖没有明显影响。2 mi R-200c或(和)mi R-141对人胃癌细胞株SGC-7901细胞侵袭转移的影响。划痕实验结果显示,划痕24小时后,与空白对照组相比,mi R-200c mimic转染组和mi R-141mimic转染组划痕愈合比例降低,但统计学没有显著差异(P=0.073,0.202)。mi R-200c Inhibitor转染组和mi R-141 Inhibitor转染组划痕愈合比例增加,但统计学没有显著差异(P=0.130,0.066);mi R-200c/141 mimics共同转染组24小时后划痕愈合比例明显降低(P0.001)。相应的,mi R-200c/141 Inhibitor共同转染组24小时后划痕愈合比例明显增加(P0.001)。Transwell实验亦得出相符结果,与空白对照组相比,mi R-200c mimic转染组和mi R-141mimic转染组24小时后每个视野下穿过细胞数减少,但统计学没有显著差异(P=0.302,0.872);mi R-200c Inhibitor转染组和mi R-141Inhibitor转染组24小时后每个视野下穿过细胞数增大,但统计学没有显著差异(P=0.089,0.057);mi R-200c/141 mimics共同转染组24小时后每个视野下穿过细胞数明显减少(P0.001)。相应的,mi R-200c/141Inhibitor共同转染组24小时后每个视野下穿过细胞数明显增加(P0.001)。mi R-200c和mi R-141抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞的侵袭转移能力。3双荧光素酶报告系统验证ZEB1和ZEB2为mi R-200c/-141的共同靶基因。双荧光素酶报告基因分析结果显示,共同转移mi R-200c/141 mimics能够显著降低ZEB1和ZEB2的相对荧光强度(P0.001,P=0.001),而单独转染mi R-200c或是mi R-141 mimics能够降低ZEB1和ZEB2的相对荧光强度,但统计学没有显著性差异。4在胃癌细胞株SGC-7901中过表达mi R-200c/141对ZEB1/2和E-cadherin表达的影响。mi R-200c/141 mimics共同转染胃癌细胞SGC-7901后,ZEB1和ZEB2m RNA和蛋白的表达水平显著降低,E-cadherin表达水平显著升高。相应地,共同转染mi R-200c/141抑制物后,ZEB1和ZEB2 m RNA和蛋白的表达水平显著升高,E-cadherin表达水平显著降低。5 ZEB1/2在胃癌中的表达情况及其与mi R-200c/141的关系。64例胃癌标本中,ZEB1和ZEB2的表达上调率都是68.75%(44/64)。相较于配对癌旁非癌组织,ZEB1和ZEB2在胃癌组织中的表达显著升高(P=0.001;P=0.004)。ZEB1的表达水平与mi R-200c表达水平显著负相关(r=-0.273,P=0.029),ZEB2的表达水平与mi R-200c和mi R-141的表达水平显著负相关(r=-0.426,-0.494;P=0.001,0.001)。结论1 mi R-200c/141可抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。2在胃癌细胞株SGC-7901中,mi R-200c/141通过靶向抑制ZEB1和ZEB2的表达,进而诱导E-cadherin的表达升高来发挥其抑制细胞侵袭转移的作用。3在胃癌患者中mi R-200c/141可能是通过ZEB1和(或)ZEB2途径调控胃癌的发展。第三部分TGF-β和mi R-200c/141 Cp G岛甲基化水平对mi R-200c/141目的:通过检测胃癌组织和配对癌旁非癌组织中TGF-β的表达水平和mi R-200c/141 Cp G岛甲基化水平,探讨其与mi R-200c和mi R-141表达水平的相关性。方法:采用q RT-PCR技术从转录水平上检测TGF-β在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达;运用MSP方法检测胃癌组织和配对癌旁非癌组织中mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化水平。分析TGF-β表达水平及mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化水平与mi R-200c和mi R-141水平的相关性。地西他滨和(或)TGF-β处理胃癌细胞株SGC-7901,观察其对mi R-200c和mi R-141表达的影响。结果1 TGF-β在胃癌中的表达情况及其与mi R-200c/141的相关性。63例胃癌标本中,TGF-β的表达上调率都是66.67%(42/63)。与配对癌旁非癌组织相比,TGF-β在胃癌组织中的表达显著升高(Median:0.84,2.50,Interquartile Range:0.42,2.43,P=0.005)。TGF-β的表达水平与mi R-200c和mi R-141的表达水平呈显著负相关关系(r=-0.364,-0.526;P=0.003,0.001)。2胃癌中mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化水平及其与mi R-200c/141的相关性。63例胃癌标本中,mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化升高率为84.13%(53/63)。与配对癌旁非癌组织相比,mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化水平在胃癌组织中显著升高(Median:0.39,0.68,Interquartile Range:0.16,0.30,P0.001)。mi R-200c/141 Cp G岛的甲基化水平与mi R-200c和mi R-141的水平呈显著负相关关系(r=-0.303,-0.522;P=0.016,0.001)。3 TGF-β与地西他滨对SGC-7901细胞中mi R-200c和mi R-141表达的影响。TGF-β诱导胃癌细胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表达显著降低(P=0.006;P=0.005)。地西他滨诱导胃癌细胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表达显著升高(P=0.013;P=0.027),并能够缓解由TGF-β诱导产生的mi R-200c和mi R-141表达的降低(P=0.005;P=0.007)。结论1胃癌中TGF-β的表达水平和mi R-200c/141Cp G岛的甲基化水平明显升高。2 TGF-β诱导胃癌中mi R-200c和mi R-141表达降低。3胃癌中升高的mi R-200c/141Cp G岛的甲基化水平诱导mi R-200c和mi R-141表达降低。4地西他滨能够通过降低mi R-200c/141Cp G岛的甲基化水平促进mi R-200c和mi R-141的表达,并能够缓解TGF-β对mi R-200c和mi R-141的抑制作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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