HMGB1在乳腺癌中的表达及其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株生物学行为影响的研究

发布时间：2019-10-12 21:51

【摘要】：研究背景：乳腺癌已成为全球第一高发的女性恶性肿瘤和女性癌症相关死亡的首要原因,过去30年中在我国的各大城市以及农村地区也均呈现显著增长,作为总人口占据世界五分之一的第一人口大国,我国有着极其庞大的乳腺癌患病人群。伴随着医学科学技术的不断进步,人们在乳腺癌的基础转化研究和临床治疗方面也取得了很大的进展,目前乳腺癌治疗即将步入“精准医疗”时代。但是应该看到的是,多年来乳腺癌的总体生存率并未得到显著提高。乳腺癌发生远处侵袭、转移是导致患者预后较差、死亡率升高的重要因素。从分子生物学角度了解乳腺癌发生发展的具体机制以及发生浸润转移的原因、寻求乳腺癌恶性转化的靶点及开发靶向性治疗药物是当前研究的热点。近年来,HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB1)对肿瘤生物学行为的影响及机制逐渐受到众多研究者的关注。HMGB1是一种在真核生物细胞中普遍表达且进化过程中高度保守的非组蛋白染色体核蛋白。多年来对HMGB1的研究揭示,其与恶性肿瘤的不断增殖、抑制细胞凋亡、促进肿瘤新生血管生成、发生侵袭和远处转移等多种生物学行为紧密相关,参与了肿瘤的发生、发展以及侵袭和远处转移全过程并发挥了重要作用,目前已成为肿瘤预防和诊治研究热点,已有多篇文献报道其在多种恶性肿瘤中的表达情况并对其作用机制进行了探讨,但对于HMGB1与乳腺癌诊治相关研究国内外报道相对较少,抑制或上调HMGB1基因表达会对乳腺癌细胞生物学行为造成哪些影响,其在疾病发生和进展过程中所起的具体作用和涉及到哪些信号通路仍不十分清楚。我们的研究旨在通过检测HMGB1在乳腺癌组织及血清中的表达情况以及观察抑制或上调HMGB1表达会对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株生物学行为造成哪些影响,并分析其影响机制,从而初步探讨HMGB1在乳腺癌疾病发生发展、侵袭转移过程中的作用。目的：(1)分别采用免疫组织化学法(IHC)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测乳腺癌患者组织及血清中HMGB1表达情况,探讨其表达与乳腺癌临床病理特征的关系及其在乳腺癌发生、发展及浸润转移中的作用机制。(2)观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制或下调HMGB1基因表达后对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞生物学行为的影响如何。(3)观察重组HMGB1(rHMGB1)刺激人乳腺癌细胞MDA-MB-231后对细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响及相关基因、蛋白的变化情况并初步探讨其可能的下游信号通路。方法：(1)采用IHC法分别检测]MGBl在乳腺癌组织、癌旁正常乳腺对照组织以及乳腺良性疾病对照组中的表达水平；采用ELISA法分别检测相对应乳腺癌组、乳腺良性疾病对照组患者血清中HMGB1的表达水平,并统计学分析组织及血清HMGB1表达水平相关性及其与临床常用病理学指标之间的关系。(2)设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNA H1、siRNA H2、siRNA H3),同时设空白对照组及阴性siRNA对照组。首先采用脂质体法将siRNA瞬时转染MDA-MB-231细胞,然后通过RT-PCR和Western blot方法检测HMGB1基因和蛋白表达水平的变化并记录各siRNA的干扰效果；从中选择出抑制作用最强的一组进入后续细胞生物学行为影响研究,分别采用噻唑蓝比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)及Transwell法检测转染HMGBl-s iRNA后MDA-MB-231细胞在增殖、周期、凋亡以及侵袭力等方面生物学行为的变化。(3)20ng/ml重组HMGB1(rHMGBl)及其抗体刺激MDA-MB-231细胞24 h,采用MTT法检测细胞增殖变化、Transwell法检测细胞侵袭力变化；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测其对MDA-MB-231细胞核因子NF-κB/p65 (nuclear factor kappa B/p65, NF-κB/p65)、基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA和蛋白表达的影响。结果：(1)HMGB1在乳腺癌组织中表达水平明显高于相对应癌旁正常乳腺组织及乳腺良性疾病组织,差异具有统计学意义(P0.05)；组织中HMGB1的表达水平与肿瘤细胞分化高低、淋巴结是否转移、肿瘤TNM分期等临床常用参数密切相关,其差异具有统计学意义(P0.05)；血清HMGB1含量在乳腺癌组亦明显高于乳腺良性疾病组和正常志愿者对照组(P0.05),但乳腺癌患者血清HMGB1表达水平与临床常用参数并无相关,且肿瘤组织HMGB1高表达组与低表达组相比较,两组血清HMGB1水平并无统计学差别(P0.05)。(2)3对特异性HMGBl-siRNAs转染MDA-MB-231细胞后,HMGB1mRNA相对表达量分别为0.448±0.045、1.148±0.038、1.118±0.078,较空白对照组的1.393±0.070明显减少(t值分别为25.393、6.878和5.867,P值均0.01)；3对特异性HMGB1-siRNAs转染MDA-MB-231细胞后,HMGB1蛋白相对表达量分别为0.143±0.040、0.353±0.032、0.394±0.019,较空白对照组的0.600±0.064明显减少(t值分别为13.540、7.718和6.900,P值均0.01),其中siRNA H1组抑制率约为70%,明显高于其他组。与空白对照组相比,MDA-MB-231细胞增殖能力在转染siRNA H1后72h、96h、120h时受到显著抑制,t值分别为7.130、30.972、25.679,P值均0.01,MTT检测结果显示：siRNA H1组细胞增殖率明显低于空白对照组及阴性siRNA对照组(P0.01)；细胞周期分布结果显示：siRNA H1组G0/G1期细胞所占比例明显高于对照组(P0.01),而S期和G2/M期细胞所占比例则显著下降(P0.01)；细胞凋亡结果显示：siRNA H1组早期、中晚期细胞凋亡率及总凋亡率均显著高于对照组(P 0.01); Transwell法结果显示,siRNA-H1组细胞侵袭能力与空白对照组和阴性siRNA对照组相比有明显下降(P0.01)。(3)MTT结果表明,MDA-MB-231细胞空白对照组与rHMGBl组、rHMGBl-抗体组、rHMGBl+IgG组、rHMGBl+rHMGB1-抗体组的吸光度分别为：0.266±0.038、0.712±0.039、0.283±0.030、0.709±0.022、0.201±0.027：重组HMGB1组MDA-MB-231细胞增殖能力明显强于空白对照组(P0.05)；20ng/mL重组HMGB1作用MDA-MB-231细胞24h后,NF-κB/p65及MMP-9mRNA相对表达量分别为1.244±0.115、1.440±0.081,较MDA-MB-231细胞空白对照组NF-κB/p65及MMP-9mRNA相对表达量为0.537±0.026、0.774±0.053显著增高,差异有统计学意义(P0.05)；重组HMGB1作用MDA-MB-231细胞24h后,NF-κB/p65、MMP-9蛋白相对含量分别为0.497±0.069、0.383±0.017,较空白对照组NF-κB/p65、MMP-9蛋白的相对含量0.402±0.050、0.294±0.014均明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。rHMGBl作用MDA-MB-231细胞24 h后,Transwell实验结果显示,重组HMGB1组透膜细胞数为379±32个,相对应空白对照组透膜细胞数则仅为204±26个,重组HMGB1组MDA-MB-231细胞侵袭力明显增强,两组差异有统计学意义(P0.05)。结论：(1)乳腺癌患者肿瘤组织以及血清中HMGB1均呈现高表达水平,且组织中表达水平与细胞分化程度高低、淋巴结有无转移、肿瘤TNM分期等临床常用参数呈密切相关,提示HMGB1作为辅助指标,在乳腺癌诊断、预后判断以及乳腺癌诊断筛查中具有一定价值。(2)HMGB1-siRNA技术可有效抑制HMGB1表达并对MDA-MB-231细胞的增殖、凋亡及侵袭力等生物学行为造成影响,可进一步探讨将HMGB1作为治疗靶点的可行性。(3)重组HMGB1组与空白对照组比较,可明显增强MDA-MB-231细胞增殖、侵袭能力,而HMGB1抗体可有效拮抗外源性HMGB1的作用。HMGB1可能是通过上调NF-κB/p65基因和蛋白的表达水平,进而激活MMP-9等下游相关信号通路,其详细作用机制尚待进一步研究。
【图文】：

乳腺癌,乳腺,HE染色,表达水平

指标逦乳腺癌逦分化程度逦淋己结转移逦ＴＮＭ分期逡逑敏感性逦７３．２１％（４１／５６）逦８６．８４％（３３／３８）逦８８．００％（２２／巧）８９．４７％（１７／１９）逡逑特异性逦８４．００％（２１／巧）逦５５．５５％（１０／１８）逦３８．邋７１％（１２／３１）逦３５．邋１４％（１３／３７）逡逑阳性预测值逦９１．邋１１％（４１／４５）逦８０．４９％（３３＾Ｕ逦５３．６６％（２２／４１）逦４１．４６％（１７／４１）逡逑阴牲预测值逦５８．邋３３％（２１／３６）逦６６．６７％（１０／１５）撕．００％（１２／：１５）逦８６．６７％（口／１５）逡逑表１－４：各姐血清ＨＭＧＢ１含量逡逑分组逦ｎ逦ｓＨＭＧＢｌ邋含量（ｎｇ／ｍｌ）逡逑乳腺癌组逦５６逦４．６４邋＋邋２．５０＊逡逑乳腺良性疾病组逦２５逦１．３２邋＋邋０．６８逡逑正常志愿者沮逦３０逦１．邋：３６±０．７５逡逑＊／＜化０５邋ＶＳ良性疾病组及正常志愿者对照姐逡逑

蛋白表达,阴性,蛋白,条带

１：空白对照姐；２：阴性ｓｉＲＮＡ对照组；３：邋ｓｉＫＮＡ邋ＨＩ组；４：邋ｓ巧ＮＡ邋Ｈ２}D；５：邋ｓ：ｉＲＮＡ组；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞转染ＨＭＧＢｌ邋ｓｉＲＮＡｓ邋７２ｈ后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＨＭ她１蛋白水平，逡逑ＷＧＡＰＤＨ为内参，计算蛋白条带与ＧＡＰＤＨ蛋白条带的相对强度，结果表明，，与阴性ＳｉＲＮ及空白对照组相比，R*邸１邋ｓｉＲＮＡｓ明显下调R*ＧＢ１蛋白表达。＊：与空白对照组比较，〈０．邋０１邋（Ｘ邋＋邋■？邋，邋１１却）逡逑表２－９：邋ｓｉＲＮＡ对ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞增殖的抑制作用（ｘ±＿ｙ，ｎ＝３）组别逦２４ｈ逦４加逦７２ｈ逦９化逦１２０ｈ逡逑空白对照逦０．３３８±０．０２４逦０．６０４邋±０．０６７逦０．６７１＋０．０２８逦１．３５４＋０．０４３逦１．１５５＋０．０５１逡逑阴性邋ＳｉＲＮＡ逦０．３７６邋＋邋０．０２２逦０．５９０邋＋邋０．０３４逦０．６８８＋０．０３２逦１．４４５＋０．０３６逦１．１３８＋０．０３６逡逑ＳｉＲＮＡ邋ＨＩ逦０．３５０邋＋邋０．０２７逦０．５１１＋０．０４８逦０．５０２＋０．０４５＊逦０．６５８邋±０．０２６＊逦０．５３０＋０．０１９＊逡逑＊；分别与空白对照姐及阴性ＳｉＲＮＡ巧比较，／＞＜０．０５逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【参考文献】