miR-760、Eaf2和QKI-5在胃癌发生发展中的功能和作用机制研究

发布时间：2019-10-13 05:20

【摘要】：胃癌是胃粘膜上皮细胞最为常见的恶性肿瘤之一,在发展中国家尤其是在中国,胃癌的发病率和死亡率均居世界前列。尽管外科手术仍被认为是胃癌治疗的最主要手段,但胃癌患者5年生存率仍不足20%。因此,除了传统的治疗方法,探索胃癌发生的潜在分子机制并寻找有效的靶向药物已成为胃癌治疗的关键问题。越来越多的研究发现,许多小分子基因在胃癌的发生发展中起着很重要的作用,如MicroRNAs (miRNAs)、环RNA (circular RNA)、 RNA结合蛋白(RBPs)、癌基因等的异常表达都有可能引起细胞生物学行为发生变化,导致肿瘤的发生。目前这些小分子基因的功能以及与此相关的基因调控已成为肿瘤研究的重点。miRNAs长度约为20～25 nt,是一类由内源基因编码的单链RNA,由约70-90nt具有发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶剪切加工后生成,miRNAs本身不翻译成蛋白质,在不同生物中主要影响转录后基因表达,从而调节细胞多种生物学过程。研究发现,miRNAs在多种癌症中存在差异表达,这些miRNAs可能起到肿瘤癌基因或抑癌基因的作用。原癌基因由于易位、倒位、突变等原因被激活后成为癌基因,所编码的蛋白质就可能会出现表达异常从而导致细胞癌变和肿瘤发生。抑癌基因的失活和沉默与肿瘤的发生也有着密不可分的关系,当抑癌基因本身出现分子生物学的改变,如基因的突变、易位和缺失等,都可能会造成抑癌基因表达失调、基因失活甚至肿瘤发生。因此,通过对原癌基因和抑癌基因的深入调查研究有助于为肿瘤的预防和治疗提供新的思路和方法。细胞中还存在一类RNA结合蛋白(RBPs)与mRNA有高度亲和性,通过与mRNA顺式调控元件直接或间接作用促进mRNA的脱腺苷化和降解。在一些和细胞增殖、分化、周期和凋亡相关的信号通路中,RBPs往往是一个关键参与因子,在正常细胞中,这些节点可以修复染色体复制过程中出现的基因异常,但由于某种原因,RBPs表达失调,就会导致癌基因及其相关炎症因子mRNA的不稳定,从而使肿瘤发生。本文通过深入开展以上研究,对阐明胃癌发生发展的功能机制研究和临床诊断具有重要意义。本文主要内容如下：1.探讨miR-760对胃癌细胞系MGC-803增殖、迁移和侵袭的影响Real-time PCR分析50例胃癌组织(C)及其癌旁组织(N)中miR-760的表达水平,用pcDNA3.1载体构建过表达miR-760的重组质粒(pcDNA-miR-760),实现miR-760在胃癌细胞MGC-803细胞中的过表达。分别用CCK-8法、Transwell和划痕实验检测MGC-803细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果显示,与癌旁组织相比,有36例(72%)胃癌组织中出现miR-760的表达下调,miR-760表达上调后能显著抑制胃癌MGC-803细胞的迁移和侵袭能力(P0.05),但对细胞增殖影响不大。说明miR-760的表达下调可能与胃癌的进展有关,过表达miR-760可以抑制MGC-803细胞的迁移和侵袭。2.探讨Eaf2基因对胃癌细胞系MGC-803增殖、迁移和侵袭的影响Real-time PCR分析50例胃癌组织(C)及其癌旁(N)中11-19赖氨酸富集白血病(eleven-nineteen lysine-rich leukemia, ELL)基因相关因子2(ELL-associatedfactor 2, Eaf2)的表达水平；用pcDNA3.1载体构建过表达Eaf2的重组质粒(pcDNA-Eaf2),实现Eaf2在MGC-803细胞中的过表达,使用CCK8、划痕实验和Transwell分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力。结果显示与癌旁组织相比,有42例(84%)胃癌组织中出现Eaf2的表达下调；Eaf2表达上调能显著抑制MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P0.05)。说明Eaf2可能在胃癌的发生发展中作为抑癌基因发挥作用。3.RBPs参与的pre-mRNA的选择性剪接在胃癌发生发展中的作用有证据表明,剪接机制在肿瘤发生过程中常常失调,而癌细胞更倾向于产生蛋白质的同源异构体从而促进细胞的生长和发育。RNA结合蛋白QKI-5在人类肿瘤和肿瘤细胞系中作为可变剪接的一个主要调节子,但其在胃癌发生发展中的生物学作用和调节机制还不是很清楚。在本实验中,我们证明了下调QKI-5的表达与胃癌患者的pTNM分期和pM分期有一定关系。再次导入QKI-5能抑制体内外细胞增殖、迁移和侵袭,可能是因为QKI-5改变了macroH2A1前体mRNA的可变剪接方式而导致macroH2A1.1同源异构体的积累。此外,QKI-5能够通过促进macroH2A1.1的可变剪接抑制CCNL1的表达。因此,本实验为胃癌的发生确定了一个新的调节机制,为胃癌的诊断和治疗提供了一个新的策略。
【图文】：

胃癌,分型

图１．３胃癌Ｂｏｒｒｍａｒｍ分型［１拍］逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｂｏｒｒｍａｎｎ邋ｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｇａｓｔｒｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑胃癌的治疗方法逡逑胃癌治疗的方法很多，主要包括ｔｉｗｉ；逡逑（１）早巧胃癌：内镜粘膜切除术巧ＭＲ），内镜粘膜下剥离术巧ＳＤ）和育癌口）晚期胃癌：首选手术治疗，对于无法手术切除的晚期胃癌主要有化疗，祀向治巧，，放化疗联合治疗和腹腔灌注化疗。逡逑胃癌的研究现状逡逑胃癌的发生除了Ｗ上环境、遗传、身体因素外，在表观遗传学方面的改变非常重要的角色。环氧合酶ＣＯＸ－２在大部分胃体腺癌及少部分贵口腺癌达上调，其异常表达与肿瘤的大小和转移关系巧关【１８４］。微卫星不稳ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ邋ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）在胃癌的发生发展中与许多细胞周期和细胞调亡

结构图,克隆载体,结构图

２．２．４构建ｍｉＲ－７６０过表达重组质粒逡逑通过分析ｍｉＲ－７６０核巧酸序列和引物特征，本实验选用表达载体ｐｃＤＮＡ，其结逡逑构如图２．２所示，表达载体的克隆位点上游有一段融合表达标签（Ｈｉｓ－Ｔａｇ标签）、逡逑ｐｃＤＮＡ为氨韦抗性。逡逑０逦％邋ｍ逡逑Ｕ逦％邋您，；Ｈ逡逑折ｃＤＮＡＧ／ＶＳ－Ｈｉｓｌ邋壚，却园逡逑１逦ｇＡＢＣ邋Ｉ邋媂，Ｖ邋Ｍ逡逑５．１邋ｋｂ逦ＮＯＮ邋却姦逡逑每Ｗ逦分栜Ｉ＂．园逡逑懿邋Ｉ逡逑Ｐｍｅ邋＼逡逑图２．２ｐｃＤＮＡ克隆载体结构图逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｐｃＤＮＡ邋ｖｅｃ化ｒ逡逑注：本研究中选用的两个跨切位点由绿色互角符号标注，分别为ＥｃｏＲｌ和Ｎｏｔｌ逡逑（１）邋ＷＭＧＣ－８０３细胞提取的ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增逡逑反应，ＰＣ氏反应体系和条件如下：逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】