【摘要】：背景与目的:近年来,尽管肺癌的检查和治疗手段取得了巨大进步,但其死亡率一直高居不下,肺癌仍然是人类目前死亡率最高的肿瘤之一,原因之一是治疗后的复发、转移及治疗的耐药性不能很好的解决。肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞群体中一小部分具有自我更新及多向分化能力,并且具有高度的侵袭和转移能力等特性的细胞。CSCs学说认为肺癌干细胞(LCSC)参与肺癌的癌变、发生发展、侵袭转移、肿瘤耐药、以及肿瘤的复发等各个过程。另有研究发现上皮间质转化(EMT)同样能够增加肿瘤的侵袭和转移能力,并且可以增加肿瘤细胞的干细胞特性,这也许是两者关系密切的重要证据。尼古丁作为烟草中重要化学物质,能够诱导包括肺癌在内的多种人类癌细胞的EMT和促进侵袭转移。尼古丁诱导侵袭和EMT的过程可能是肺癌发生耐药和转移的重要机制,可能对肺癌干细胞能够产生同样的作用。阐明EMT相关信号通路与LCSC相互作用机制,有望为吸烟肺癌患者的后续治疗开辟新途径。本研究目的主要是富集肺癌干细胞,检测其干细胞特性,并探索尼古丁诱导的EMT对肺癌干细胞的作用,为后续进一步分子机制研究奠定基础。材料与方法:(1)以人肺腺癌A549细胞株为研究对象;(2)应用划痕实验和Transwell侵袭实验研究不同浓度尼古丁对肺癌细胞株迁移和侵袭能力的作用;(3)通过使用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁对肺癌细胞EMT相关表面标志物m RNA和蛋白水平的影响;(4)通过免疫荧光技术检测尼古丁诱导肺癌细胞EMT,发生β-catenin蛋白表达核转移;(5)使用无血清悬浮培养法富集肺癌细胞球细胞;(6)应用流式细胞仪检测侧群细胞(SP)在细胞球细胞和亲代肺癌细胞间的含量差异;(7)应用流式细胞仪检测CD133在细胞球细胞和亲代肺癌细胞中表达差异;(8)应用Real-time PCR技术检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中ABCG2和CD133的m RNA表达水平差异,Western blot方法检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中ABCG2蛋白表达差异;(9)流式细胞术检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中的细胞周期差异;(10)应用CCK8法测定顺铂对肺癌细胞球细胞和亲代肺癌细胞株的半数抑制浓度(IC50),绘制浓度-抑制率回归曲线;(11)应用Transwell侵袭实验比较细胞球细胞和亲代肺癌细胞株体外侵袭能力差异;(12)应用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁对细胞球细胞EMT相关表面标志物m RNA和蛋白水平的影响;(13)通过Transwell侵袭实验研究尼古丁对细胞球细胞侵袭能力的影响;结果:(1)0.1、1、10μmol/L尼古丁处理肺癌细胞株24h、48h后进入划痕区域细胞数量较0μmol/L组显著增多,划痕区域面积明显缩小,经方差分析尼古丁处理组迁移能力显著高于未处理组(P=0.000)。(2)1μmol/L和0μmol/L尼古丁处理细胞后,Transwell侵袭实验穿过基底膜的肺癌细胞数量为:106±2和67±2,尼古丁处理组细胞侵袭能力显著增强(P=0.000)。(3)尼古丁处理肺癌细胞株48h后,E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。0.1、1、10μmol/L尼古丁处理的肺癌细胞后,E-cadherin m RNA表达(0.81±0.03,0.49±0.01,0.39±0.05)低于未处理组细胞(1.00±0.12),与未处理组E-cadherin m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理肺癌细胞后,Vimentin m RNA表达(1.64±0.07,2.03±0.06,2.35±0.10)明显高于未处理组细胞(1.00±0.12),与未处理组Vimentin m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,E-cadherin蛋白表达(0.27±0.002,0.25±0.005,0.18±0.003)低于未处理组细胞(0.30±0.003),与未处理组E-cadherin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,Vimentin蛋白表达(0.52±0.008,0.86±0.005,1.14±0.010)高于未处理组细胞(0.37±0.005),与未处理组Vimentin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁处理24,48,72h的肺癌细胞组E-cadherin蛋白表达(0.47±0.009,0.31±0.008,0.23±0.003)低于未处理组细胞(0.69±0.001),与未处理组E-cadherin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁处理24,48,72h的肺癌细胞组Vimentin蛋白表达(0.09±0.003,0.32±0.003,0.40±0.003)高于未处理组细胞(0.06±0.002),与未处理组Vimentin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.002,0.000,0.000);(4)1μmol/L尼古丁处理肺癌细胞48h后,免疫荧光检测显示β-catenin蛋白发生核转移。(5)无血清悬浮培养能够形成细胞球细胞,且细胞球可稳定传代。(6)细胞球细胞SP阳性比例(12.36±1.47%)显著高于亲代肺癌细胞(5.79±0.11%),两组间SP表达比较具有显著性差异(P=0.000)。(7)细胞球细胞表面标志物CD133表达(15.90±0.32%)显著高于亲代肺癌细胞(0.40±0.02%),两组间CD133表达比较具有显著性差异(P=0.000)。(8)细胞球细胞CD133 m RNA表达(1.45±0.02)显著高于亲代细胞(1.00±0.07),两组间CD133 m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.001)。(9)细胞球细胞ABCG2 m RNA表达(1.48±0.05)显著高于亲代细胞(1.00±0.05),两组间ABCG2 m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000);细胞球细胞ABCG2蛋白表达(0.75±0.001)显著高于亲代细胞(0.20±0.004),两组间ABCG2蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000)。(10)细胞球细胞和亲代肺癌细胞株的细胞周期分布经F检验有显著性差异(P=0.000)。细胞周期两两比较:细胞球细胞G0/G1期细胞含量(79.55±1.63%)显著高于亲代肺癌细胞(53.15±2.19%),两组间比较具有显著性差异(P=0.005);细胞球细胞G2/M期细胞含量(18.85±1.48%)与亲代细胞(19.75±4.03%),两组比较无明显差异(P=0.795);细胞球细胞S期细胞含量(1.62±0.06%)显著低于亲代细胞(27.15±1.91%),两组间比较具有显著性差异(P=0.003)。(11)细胞球细胞对DDP的IC50值(7.07±0.85μg/L)显著高于亲代细胞(2.25±0.35μg/L),两组细胞对DDP 48h的IC50值比较有显著性差异(P=0.000)。(12)细胞球细胞和亲代肺癌细胞株Transwell侵袭实验穿过基底膜的细胞数量分别为:85±4和67±2,细胞球组穿过基底膜细胞数量明显增多(P=0.001)。(13)肺癌细胞球细胞经尼古丁处理后EMT相关标志物E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。1μmol/L尼古丁处理48h的肺癌细胞组E-cadherin m RNA表达(0.60±0.02)低于未处理组细胞(1.00±0.12),两组间E-cadherin m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000);1μmol/L尼古丁处理处理48h的肺癌细胞组Vimentin m RNA表达(1.21±0.03)高于未处理组细胞(1.00±0.03),两组间Vimentin m RNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.001);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,E-cadherin蛋白表达(0.55±0.030,0.40±0.011,0.22±0.014)低于未处理组细胞(0.79±0.008),与未处理组E-cadherin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,Vimentin蛋白表达(0.18±0.009,0.43±0.011,0.54±0.002)高于未处理组细胞(0.15±0.002),与未处理组Vimentin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁处理24,48,72h的肺癌细胞组E-cadherin蛋白表达(0.39±0.005,0.34±0.004,0.26±0.005)低于未处理组细胞(0.53±0.008),与未处理组E-cadherin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁处理24,48,72h的肺癌细胞组Vimentin蛋白表达(0.17±0.002,0.22±0.003,0.25±0.002)高于未处理组细胞(0.13±0.006),与未处理组Vimentin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.004,0.000,0.000);(14)1μmol/L和0μmol/L尼古丁处理细胞球细胞后,Transwell侵袭实验穿过基底膜的细胞数量为:140±8和85±4,1μmol/L细胞球组数量显著增多(P=0.000)。结论:(1)尼古丁处理肺癌细胞后从表面标志物表达水平和生物学行为上均表现出明显EMT现象,侵袭能力呈现剂量和时间依赖性显著增强;(2)通过无血清悬浮培养得到肺癌细胞球细胞具有显著增强的自我更新、增殖、分化、耐药及体外侵袭迁移能力,细胞球细胞多处于细胞周期静止期,高表达ABCG2基因,并显著高表达肿瘤干细胞标志物,细胞球细胞可作为肺癌干细胞进行后续实验;(3)尼古丁可以诱导肺癌细胞球细胞即肺癌干细胞EMT,促进其侵袭转移。
【图文】：
理后A549细胞进入划痕区域细胞数量较0μmol/L组显著增多，，差异具有统计学意义（P=0.000）。不同浓度尼古丁处理后能够增强A549细胞迁移能力，并呈现浓度和时间依赖性提高细胞迁移能力(图1.1，表1.7)。
图1.2 Transwell侵袭实验 A：对照组；B： 尼古丁处理组(×200)表1.8 尼古丁处理组和普通细胞侵袭能力比较尼古丁浓度（μmol/L） 穿过基底膜细胞数量（个） P0 67±20.0001 106±23 尼古丁对肺癌细胞 EMT 相关 mRNA 表达的影响（1）细胞总 RNA 检测测定所有细胞总RNA浓度及其OD 260/280比例均在1.8～2.0之间(最佳范围.6-2.1)，细胞所提取RNA纯度较高（表1.9）。A B
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：
2549565
