长链非编码RNA在H.pylori感染相关胃癌中的作用及机制研究

发布时间：2019-11-01 04:05

【摘要】：长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达,广泛地参与细胞分化、个体发育等重要生物学过程,并参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展过程。众多在肿瘤中发挥促癌作用或抑癌作用的lncRNA被相继报道,提示lncRNA可作为肿瘤诊断、治疗的潜在靶点。胃癌是常见的恶性肿瘤之一,世界范围内胃癌位居恶性肿瘤死亡率的第二位,严重威胁着人类的健康。胃癌的发病机制异常复杂,涉及多步骤多环节。环境因素、遗传因素及宿主特性等在胃癌的发生发展中发挥重要作用。其中,幽门螺杆菌H.pylori(Hp)感染宿主胃粘膜被认为是胃癌的重要致癌因子。国际癌症研究机构(International Agency For Research on Cancer,IARC)将H.pylo 列为 Ⅰ 类致癌因子,与胃癌发生显著相关。H.pylori感染能够引发胃粘膜慢性炎症,历经不同进展期最终癌变。H.pylori感染与胃癌发病的具体分子机制尚未完全明了。本研究旨在利用高通量芯片技术筛选H.pylori感染相关胃癌中差异表达的lncRNA,对其发挥的生物学功能及分子机制进行研究,为胃癌的诊断和治疗提供分子生物学基础。本研究利用新鲜培养的H.pylori菌株感染正常人胃粘膜上皮GES-1细胞构建H.pylori感染细胞模型。通过高通量芯片杂交技术检测Hpylori感染模型中差异表达的lncRNA及mRNA。同时,对人正常胃粘膜组织,H.pylori阳性胃炎组织及Hpylori阳性胃癌组织进行表达谱分析。在芯片结果中,众多与细胞周期、基因组稳定性相关的mRNA表达水平发生显著改变。利用生物信息学分析方法对这些与基因组稳定性相关的mRNA与差异表达的lncRNA进行共表达网络分析。根据共表达网络分析结果,选择lncRNA SNHG17(small nuclear RNA host gene 17)进行深入研究。首先利用 qRT-PCR 技术检测了在正常人胃粘膜组织发展至胃癌的不同进展期中SNHG17的表达情况。结果表明,随着感染进程的推进,SNHG17的表达水平也随之逐渐上调。并且SNHG17在Hp阳性胃粘膜组织中的表达水平显著高于Hp阴性组织,原位杂交实验证实SNHG17主要定位于细胞核内。研究SNHG17的体外功能发现,敲低SNHG17的表达对细胞的增殖没有明显影响,但抑制SNHG17可使Hp感染引发的基因组DNA双链断裂显著减少。为了探究SNHG17的体内功能,包装获得可抑制SNHG17表达的慢病毒,构建敲低SNHG17的稳转细胞株。通过皮下注射的方式接种裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型,观察对照组及实验组细胞在裸鼠体内的成瘤能力。当实验组及对照组细胞皮下瘤体生长至50mm3时,以10Gy剂量的电离辐射IR局部照射瘤体,继续观察生长情况。结果发现SNHG17敲低组细胞在电离辐射处理下,其成瘤能力显著低于对照组。应用免疫组织化学方法检测两组裸鼠肿瘤组织,发现SNHG17敲低组中基因组DNA双链断裂显著减少,提示SNHG17可能通过影响基因组稳定性对胃癌细胞的生长产生影响。为了研究SNHG17发挥功能的分子机制,我们利用RNA-pulldown联合质谱技术寻找在Hp感染时与SNHG17相互作用的蛋白。根据质谱结果,筛选出与SNHG17可能相互作用的蛋白 NONO(non-POU domain containing octamer-binding protein)。利用western blot实验及RIP进行验证,发现SNHG17确实能够与NONO蛋白相互作用。利用RBPDB数据库分析发现SNHG17转录本第716-720位置存在NONO蛋白的结合位点,将该结合位点突变后进行RNA-pulldown实验,发现NONO蛋白与SNHG17的结合能力显著减弱,提示SNHG17在第716-720位与NONO蛋白结合。同时,GST pulldown实验证实NONO蛋白的RNA结合结构域RRM1及RRM2均能够与SNHG17结合,以上结果证实NONO蛋白可与SNHG17结合。进一步研究发现敲低SNHG17并不影响NONO的蛋白表达水平,NONO表达水平的改变也不影响SNHG17的表达,提示二者的结合对各自的稳定性并无影响。在胃癌细胞中敲低NONO的表达,发现基因组DNA双链断裂显著增加,DNA损伤修复蛋白Ku80显著下降,表明NONO参与了 Hp感染过程中基因组DNA双链断裂的修复。以上结果提示SNHG17可能通过和NONO蛋白结合抑制了 Hp感染过程中的DNA损伤修复。综上所述,本研究利用lncRNA表达谱芯片技术筛选得到与Hp感染密切相关的lncRNA SNHG17。对其功能进行深入研究,发现SNHG17与Hp感染引起的基因组稳定性变化密切相关。SNHG17上存在NONO蛋白的结合位点,可与NONO蛋白直接结合。因此,通过以上研究发现SNHG17是在Hp感染过程中引起的关键lncRNA,其功能与基因组稳定性密切相关,可能成为胃癌的预防、诊断和治疗的新的靶标分子。
【图文】：

逦北京协和医学院博士研宄生学位论文逦逡逑结果逡逑一、丨ｎｃＲＮＡ表达谱芯片筛选差异表达的ＩｎｃＲＮＡ逡逑１．建立Ｈｐ感染细胞模型逡逑为了研宄ＩｎｃＲＮＡ在Ｈｐ感染相关的胃癌中的作用，我们建立了邋Ｈｐ感染细胞逡逑模型。首先，固体培养基法培养Ｈｐ国际标准菌株（ＮＣＴＣ１１６３７）至７２ｈ时，对菌逡逑落进行革兰氏染色及ＰＣＲ鉴定。幽门螺杆菌为革兰氏阴性菌，呈海鸥状、弧形或Ｓ逡逑形。结果如图１．１Ａ所示，革兰氏染色结果为紫色，菌落形状为弧形或Ｓ形，证实逡逑培养的菌落为Ｈｐ，可用于感染实验。接着，利用培养的新鲜Ｈｐ菌液以感染复数（ＭＯＩ）逡逑为１邋：邋２００的比例侵染人胃粘膜正常上皮细胞ＧＥＳ－１。侵染６ｈ后提取细胞总ＲＮＡ，逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ检测发现Ｈｐ侵染组中Ｈｐ菌株ｃａｇＡ基因表达呈阳性，ＩＬ－８表达水平显著逡逑上调，显示Ｈｐ感染细胞模型构建成功（图１．１．Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑

图１．２邋ＩｎｃＲＮＡ／ｍＲＮ?
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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本文编号：2553975