胰岛素样生长因子2在肿瘤干细胞中的印记丢失及机制研究

发布时间：2019-11-01 17:07

【摘要】：肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的发现是肿瘤研究的里程碑,CSCs在肿瘤的靶向治疗中具有潜在的应用前景。肿瘤细胞中既包含CSCs,也包含非干性肿瘤细胞(non-Stem Cancer Cells,n SCCs),CSCs是存在于肿瘤细胞中的一小群具有异质性的细胞。通常情况下CSCs在肿瘤细胞中所占比例不足1%,但却决定着肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及耐药。目前已经在多种恶性肿瘤中分离出CSCs,常规的肿瘤治疗手段通常可以杀灭绝大部分的肿瘤细胞,但是难以杀灭CSCs,从而成为肿瘤的复发和转移的根源。因此肿瘤根治的关键是清除CSCs,因此探讨针对CSCs的靶向治疗手段成为目前研究的重点和热点。生长激素/胰岛素样生长因子轴在调控CSCs自我更新能力中扮演着重要角色,研究已发现在多种肿瘤中存在IGF通路的激活。通过刺激PI3K和MAPK级联途径,IGF1和IGF2促进细胞增殖并诱导肿瘤细胞对放化疗及靶向治疗的抵抗。在大多数正常组织中IGF2是母源印记的,仅表达父源等位基因。但是在许多肿瘤中存在这种印记表达的丢失,从而导致了IGF2基因的双等位表达。研究表明这种异常高表达的IGF2加强了CSCs的自我更新,并促进肿瘤细胞的增殖,IGF2印记丢失与肿瘤的起源密切相关。目前关于IGF2印记丢失在CSCs“干性”维持及自我更新中的作用研究较少。目的:(1)分析IGF2在CSCs中的印记丢失情况,并比较CSCs和n SCCs的印记表达差异;(2)研究IGF2印记丢失在维持CSCs干性、自我更新能力及放化疗抵抗中发挥的作用;(3)探究CSCs中IGF2印记丢失的表观调控机制。方法:(1)利用流式细胞分选技术通过CD133抗体标记从实体肿瘤细胞分离出CSCs;(2)采用无血清悬浮培养法富集CSCs用于下一步印记分析等实验;(3)通过成球实验、免疫荧光染色和流式细胞术CSC标志蛋白表达测定等实验鉴定CSCs;(4)通过测序法研究IGF2在CSCs中的印记表达情况;(5)应用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表达;应用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表达;(6)通过软琼脂克隆形成实验检测CSCs的克隆形成能力;(7)采用WST-1细胞增殖实验评估CSCs对放化疗敏感性;(8)利用染色质构象捕获技术(3C)研究CSCs染色质内部空间结构;(9)利用染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)研究IGF2的印记表达与H3K27甲基化的相关性;(10)应用小RNA干扰的方法建立IGF2瞬时干涉细胞模型,通过细胞增殖实验、细胞周期及凋亡测定、细胞迁移及侵袭试验等,研究IGF2在维持CSCs特性中发挥的作用。结果:(1)利用流式细胞分选技术通过CD133抗体标记从6种实体肿瘤细胞分离出CSCs和Non-CSCs。CSCs可在干细胞培养基中成球培养,连续消化传代后仍保持与原代相同的形态特征;(2)应用免疫荧光技术发现CSC标志物CD133和乙醛脱氢酶(ALDH)在6种CSCs表面持续阳性表达;(3)采用流式细胞仪对分选前后的肿瘤细胞进行CD133+表达的检测,结果显示超过90%的成球细胞为CD133阳性;(4)通过测序法测定IGF2在CSCs中的印记表达情况,结果显示CSCs中存在IGF2印记丢失。即使来源于IGF2印记保持细胞株的CSCs也存在IGF2印记丢失现象;(5)应用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表达,结果显示与non-CSCs相比IGF2在CSCs中的表达明显升高;应用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表达,结果显示与non-CSCs相比,IGF2在CSCs中的表达明显升高;(6)应用软琼脂克隆形成实验检测CSCs的克隆形成能力,结果显示CSCs中IGF2的表达上调导致肿瘤克隆形成能力增强;(7)采用WST-1细胞增殖实验评估CSCs对放化疗的敏感性,结果发现与non-CSCs相比,IGF2高表达的CSCs对5-FU和奥沙利铂的耐药性增强,对放疗的抵抗能力增强;(8)利用染色质构象捕获技术(3C)检测CSCs染色质内部空间结构,结果显示CSCs中的染色质内连接产物信号强度明显降低;(9)利用染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)检测了IGF2启动子上H3K27甲基化水平,结果发现CSCs中IGF2启动子H3K27甲基化水平明显降低,导致对IGF2启动子的抑制作用降低;(10)应用小RNA干扰的方法建立IGF2瞬时干涉细胞模型,研究IGF2在维持CSCs特性中发挥的作用。结果显示:干涉IGF2基因后,CSCs中CD133+的比例明显降低,细胞增殖受到明显抑制,细胞周期发生改变(G2/M期细胞增多,G0/G1减少),凋亡增加,迁移和侵袭能力下降,对放化疗的敏感性增强。结论:(1)CSCs中存在IGF2印记丢失,IGF2印记丢失可能是CSCs的标志性特征之一;(2)CSCs中IGF2印记丢失在维持CSCs特性中发挥重要作用,并促进了CSCs的自我更新及放化疗抵抗;(3)CSCs中IGF2印记丢失与染色质内环结构消失及组蛋白H3K27甲基化这一基因表观遗传修饰相关。
【图文】：

DMR/ ICR是甲基化的，CTCF不能结合，增强子可以作用于IGF2的启动子。相反，，在母源染色体中，CTCF形成了染色质绝缘体，阻断了激活IGF2的增强子（见下图1.3A）。图1.3 A. IGF2-H19基因位点上的印记调控示意图[25]B. CTCF介导的X染色体失活中等位基因特异性抑制模型[26-28]Figure 1.3 A.Schematic diagram of regulation of imprinting on IGF2-H19 gene[25]B.Allele-specific Inhibition model in CTCF-mediated X chromosome inactivation[26-28]DMR：差异甲基化区域。Lollipops：甲基化的CpG：Xi：失活的X染色体。Xa：激活的X染色体。鼠的IGF2基因是第一个被发现的印记基因，是等位基因特异性抑制表达的典型模型，即X染色体失活，雌性哺乳动物的每个体细胞染色体XX中均有一个X沉默，相应的基因量由具有XY染色体的雄性个体补充[23]。目前，关于IGF2印记表达和X染色体失活的表观遗传调控机制研究较为充分，而且随着这些研究的深入，我们逐渐发现在肿瘤中

失致使 IGF2 异常的高表达，进而导致多种疾病的发生、心血管疾病和肿瘤的发病密切相关。心血管疾病和肿年病领域的地位更是极为重要，对这两类疾病的深入研目前恶性肿瘤是人类死亡的主要元凶，据世界卫生组织性肿瘤的人数已经超过心血管疾病，并以逐步增长的速机制及治疗进展等方面的研究意义更为重大。织中，机体精确地调节IGF2单等位基因的表达，以控制究表明，正常情况下机体准确表达IGF2，在正常健康的的调控，IGF2只表达来自父源等位基因，而母源等位基常发育，这种现象被称为基因组印记保持（maintenan病理情况下出现调控紊乱，处于印记状态IGF2也可重新改变，称为基因组印记丢失（图1.4）。IGF2印记丢失从而引发多种疾病。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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本文编号：2554041