RSK2在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞功能的影响与机制研究

发布时间：2019-11-06 02:35

【摘要】：目的:探讨RSK2在人骨肉瘤组织中的表达及其临床意义,并进一步研究RSK2对人骨肉瘤细胞的生物学功能影响及其相关作用机制。方法:1、收集临床骨肉瘤手术及穿刺活检标本,应用免疫组织化学技术检测RSK2在30例骨肉瘤、15例正常瘤旁组织中(取自距肿瘤组织3cm以外)的表达,并分析RSK2的表达与骨肉瘤临床病理参数的关系。2、检测RSK2基因在骨肉瘤细胞株MG-63、143B、U2-OS中的表达水平。构建RSK2 shRNA,并应用RT-PCR技术和Western-blot技术验证其干扰效果。应用流式细胞术检测细胞周期变化情况及细胞凋亡情况。CCK8法检测RSK2基因沉默后对骨肉瘤细胞增殖的影响及对化疗药物敏感性的变化。应用裸鼠皮下成瘤技术,观察RSK2基因沉默前后成瘤能力的变化。应用Transwell技术观察RSK2基因沉默前后迁移能力的变化。3、应用shRNA干扰技术沉默骨肉瘤细胞内RSK2基因表达后,用Western Blot法分别检测三株骨肉瘤细胞内MAPK/ERK信号通路中上游分子ERK及下游分子c-Fos的表达,探讨骨肉瘤中RSK2在MAPK信号通路中的作用;检测akt/mtor信号通路中关键分子akt及mtor的变化,探讨骨肉瘤中rsk2在akt/mtor信号通路中的作用;检测凋亡通路关键分子bcl2/bax/caspase-3的变化,探讨骨肉瘤细胞株中rsk2shrna促凋亡的作用机制。结果:1、免疫组化结果显示(1)30例骨肉瘤组织rsk2大部分呈高表达,15例瘤旁正常肌肉组织rsk2均不表达或低表达。rsk2在骨肉瘤组织及正常瘤旁组织中的阳性表达率分别为86.67%、26.67%,两者比较差异有统计学意义(p0.05)。(2)rsk2的表达与骨肉瘤的大小密切相关,直径大于3cm的肿瘤rsk2表达阳性率95%(19/20例)显著高于直径小于3cm的骨肉瘤的阳性率70%(7/10例),两者比较,差别具有统计学意义(p0.05)。(3)rsk2在骨肉瘤组织中的表达不具有性别差异,男性阳性率为86.67%(18/21),女性阳性率为88.89%(8/9),两者比较差异无统计学意义(p0.05)。(4)rsk2与临床病理i、ii、iii级之间阳性表达率分别为66.67%、90.91%与92.30%,i级与ii、iii级之间差异明显,有统计学意义(p0.05)。ii级和iii级之间差异无统计学意义(p0.05)。(5)rsk2与临床分期i、ii、iii期之间阳性表达率分别为50%、95.45%与100%,阳性表达率与临床分期呈正相关性,且低度恶性与高度恶性(i期与ii期)之间差异明显,有统计学意义(p0.05)。(6)rsk2与碱性磷酸酶升高程度相关,升高与未升高患者中阳性表达率分别为91.67%、66.67%,差异有统计学意义(p0.05)。2、rt-pcr和westernblot结果证实3种人骨肉瘤细胞株中rsk2均有明显的表达。我们构建的rsk2shrna可很好地沉默三株骨肉瘤细胞的rsk2的表达,在mrna和蛋白水平均得到了很好地验证。流式细胞仪检测结果显示,rsk2shrna作用于骨肉瘤细胞后,细胞凋亡率明显的增加,以晚期凋亡增加为主。细胞周期也发生了明显的改变,g1期阻滞明显增加,而s、g2期比例降低。cck8法测细胞增殖曲线结果显示,rsk2shrna作用于骨肉瘤细胞后,细胞增殖速度明显降低。transwell结果显示骨肉瘤细胞在rsk2shrna作用后迁移穿过transwell室间膜的能力明显降低。裸鼠皮下移植成瘤结果显示,rsk2作用于骨肉瘤细胞后,骨肉瘤细胞的裸鼠皮下成瘤体积较正常骨肉瘤细胞明显减小,移植瘤组织切片pcna和ki67增殖核抗原染色结果显示,骨肉瘤细胞在rsk2shrna作用后增殖率明显降低。cck8法测骨肉瘤细胞对化疗药物顺铂及多柔比星的药物敏感性,顺铂的半数有效抑制浓度在三株骨肉瘤细胞分别由干扰前的4.66、4.71、4.83ng/ul,降低为干扰后的3.4、3.91、3.79ng/ul,多柔比星的半数有效抑制浓度分别由干扰前的2.08、2.13、2.05ng/ul降低为术后的1.11、1.04、1.10ng/ul,rsk2shrna作用后骨肉瘤细胞对两种药物的半数有效浓度均明显降低。3、与阴性对照组及阳性对照组相比,rsk2基因沉默后的骨肉瘤细胞株mg-63、143b、u2-os中erk及磷酸化erk蛋白表达没有明显差异(p0.05);但c-fos蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(p0.05);akt/mtor信号通路中重要的靶基因p-akt及p-mtor表达明显降低,差异有统计学意义(P0.05);凋亡相关信号分子Bcl2蛋白表达量明显增加,Bax蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P0.05),caspase-3表达无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。结论:1、RSK2在正常瘤旁组织中不表达或低表达,在骨肉瘤组织中高表达。骨肉瘤组织中,RSK2的表达与肿瘤原发灶大小、临床分期、病理分级及碱性磷酸酶升高程度有关,但与性别、年龄无关。2、人骨肉瘤细胞中存在RSK2的表达,RSK2 shRNA可有效地沉默RSK2基因的表达。降低RSK2的表达可降低骨肉瘤细胞增殖速度和移植瘤的增殖指数,降低细胞迁移能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期,增加化疗药物敏感性。3、RSK2沉默可能通过AKT/mTOR通路及Bcl2/Bax通路作用于骨肉瘤细胞。敲除RSK2可降低c-Fos的表达,影响骨肉瘤细胞的功能。RSK2沉默不能逆向刺激ERK的表达,也不通过caspase3影响骨肉瘤的发生发展。
【图文】：

示意图,骨肉瘤,示意图,阴性

图 1.1 骨肉瘤组织 RSK2 染色示意图。3+代表强阳性，2+代表阳性，1+代表弱阳性，0+代阴性。Fig.1.1 Expression of RSK2 protein in osteosarcomes. 3+ manifesting strongly positive cells, 2

细胞RNA

骨肉瘤细胞株中RSK2mRNA的表达情况
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

【参考文献】