Endostatin高表达对巨噬细胞极化的影响及其机制的研究

发布时间：2019-11-06 22:26

【摘要】：背景:在实体肿瘤组织中,除大量肿瘤细胞外,还包括成纤维细胞、内皮细胞、细胞外基质和免疫细胞。浸润到肿瘤组织的免疫细胞包括:巨噬细胞、树突状细胞(DC)和淋巴细胞,这些免疫细胞在肿瘤组织中形成炎症微环境,其中的巨噬细胞有助于肿瘤细胞的生长和扩散,并抑制抗肿瘤免疫反应,从而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。大多数肿瘤组织中都有巨噬细胞的聚集,后者通过分泌细胞因子、生长因子、趋化因子和基质降解酶,直接参与内皮细胞的功能,并通过细胞外基质的重建促进内皮细胞的迁移。目前肿瘤对各种治疗方法(包括放疗、化疗以及抗血管药物)呈现耐受状态,其可能原因是:这些治疗方法均可增加肿瘤组织中巨噬细胞的浸润,从而打破肿瘤微环境中促血管信号通路和抗血管信号通路之间的平衡。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)源自血液系统的单核细胞,在趋化因子的作用下进入肿瘤组织分化为TAMs。肿瘤细胞分泌的集落刺激因子可延长TAMs的存活时间。当TAMs在肿瘤环境中被适度激活(即M1型)时,发挥抗肿瘤免疫功能,可杀死肿瘤细胞并破坏血管内皮,从而抑制肿瘤的发展。但是,如果这种刺激未在短时间内受到抑制,TAMs将在肿瘤细胞分泌的多种细胞因子的作用下极化为M2型,这也是肿瘤组织中的TAMs大多数为M2型的原因。与M1型相反,M2型TAMs的作用包括分泌生长因子、血管生成因子及蛋白酶,从而刺激肿瘤细胞增殖、降解细胞外基质、促进血管生成和肿瘤细胞的侵袭与迁移,并逃脱抗肿瘤免疫的监视。因此,诱导肿瘤组织中的TAMs发生二次极化,使M2型TAMs向M1型极化转变成为近年来肿瘤治疗的一个重要靶点。Endostatin是目前发现的最有效的血管生成抑制剂之一,可通过抑制内皮细胞的增殖和迁移,抑制肿瘤血管的生成,进而抑制肿瘤的生长和转移。近几年的研究发现,除抑制血管生成外,Endostatin还具有一定的免疫学效应。用Endostatin处理荷瘤小鼠可诱导大量的白细胞浸润,并增加细胞毒性淋巴细胞的浸润,抑制肿瘤免疫逃逸细胞—Treg细胞的活化,提示Endostatin可增强肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应。TAMs偏爱缺氧环境,常聚集于无血管区域和坏死区域。VEGF可诱导单核细胞到达肿瘤部位形成TAMs并极化为M2型,而TAMs自身可分泌血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等多种血管生长因子,从而形成恶性循环。此外,胎盘生长因子(PIGF)也可激活肿瘤中异常血管的生成,并且抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应,促进TAM向具有促肿瘤、促血管生成功能的M2型发生极化。因此,我们推测Endostatin对肿瘤的抑制作用除了影响肿瘤血管的生成,还可通过抑制VEGF和PIGF的表达影响TAMs的极化。目的:通过转染p Endostatin表达质粒,上调Endostatin的表达,通过体内外实验观察Endostatin对巨噬细胞极化的影响,以及Endostatin诱导的巨噬细胞活化对肿瘤细胞的影响,并初步探讨其可能的机制。方法:体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7和骨髓巨噬细胞BMDMs,将细胞分为Control组、p Scramble组和p Endostatin组,分别瞬时转染空质粒和表达分泌型Endostatin的p Endostatin质粒。MTT和HE染色方法检测巨噬细胞的增殖活性和形态;流式细胞术检测M1型和M2型相关标记物表达阳性巨噬细胞的比例;ELISA和q RT-PCR方法检测与巨噬细胞极化相关标记物蛋白表达和m RNA的表达变化。荧光素酶报告基因检测巨噬细胞中NF-κB的活性变化;Western blot方法检测NF-κB相关基因及其下游基因的表达变化。将小鼠乳腺癌细胞4T1和黑色素瘤细胞B16分别与正常RAW264.7细胞(Control组)及转染p Endostatin的RAW264.7细胞(M1组)共培养48h,重新收集4T1细胞和B16细胞进行以下实验。实验分组:Control组和M1组。MTT和细胞集落形成实验观察M1型巨噬细胞对肿瘤细胞增殖活性的影响;划痕实验和Transwell侵袭实验观察M1型巨噬细胞对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术观察M1型巨噬细胞对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响;Western blot检测相关蛋白表达水平的变化。构建小鼠乳腺癌移植瘤模型,将小鼠分为Control组、PQ组、SL/p Scramble组和SL/p Endostatin组。以具有肿瘤靶向性的减毒沙门氏菌为运载体,携带p Scramble和p Endostatin质粒,以腹腔注射的方式给予小鼠,观察并计算肿瘤生长指数和肿瘤指数,免疫组织化学染色和扫描电镜观察Endostatin对肿瘤血管的影响;流式细胞术观察TAMs中M1型和M2型的比例变化;ELISA和q RT-PCR方法观察肿瘤中巨噬细胞极化相关标记物的表达变化。结果:转染p Endostatin表达质粒后,RAW264.7和BMDMs细胞中Endostatin表达水平明显上调。Endostatin表达上调可诱导RAW264.7和BMDMs极化为M1型巨噬细胞,增强细胞中NF-κB的转录活性,上调p-p65、p-STAT1的表达,并下调p-STAT3、VEGF-A和PIGF的表达。Endostatin诱导的M1型巨噬细胞可抑制4T1细胞和B16细胞的增殖活性和迁移能力,并使PCNA、MMP-2和MMP-9的表达水平下降;同时它也能够促进B16细胞的凋亡,并上调B16细胞中c-Caspase3、c-Caspase8和Bax的表达,下调Bcl-2的表达,但是对4T1细胞的凋亡没有影响;Endostatin诱导的M1型巨噬细胞可促使4T1细胞发生G2期阻滞,并上调4T1细胞中p21、CDK1和Cyclin B1的表达,但对B16细胞的细胞周期未见影响。Endostatin可抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生长,减少肿瘤组织中M2型TAMs的比例,增加M1型TAMs的比例;抑制肿瘤组织中VEGF-A和PIGF的表达,减少肿瘤组织中的血管生成并使其形态正常化。说明Endostatin能够改变体内TAMs的极化类型。结论:Endostatin表达增加可通过增强NF-κB转录活性,从而影响其下游基因的表达,诱导RAW264.7和BMDMs细胞发生M1型极化,从而抑制4T1细胞和B16细胞的增殖,使其分别发生细胞周期阻滞和细胞凋亡。Endostatin表达增加还可通过抑制VEGF-A和PIGF的表达,使TAMs向M1型极化,从而增强抗肿瘤免疫效应。
【图文】：

巨噬细胞,替代性,活化的,亚型

图 1.1 Macrophages in development, homeostasis and disease. 替代性活化的巨噬细胞（M2）M2 型巨噬细胞有免疫抑制功能，并能释放抗炎细胞因子增强 TH2 型它可进一步分为四类亚型：M2a、M2b、M2c 和 M2d。Th2 型细胞因和 IL-13）能够刺激巨噬细胞极化为 M2a 亚型，，而 TLRs 和免疫复合形成 M2b 亚型，IL-10 可诱导其极化为 M2c 亚型。在肿瘤中，巨噬细的主要组成部分，这种环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（TA研究证明：TAMs 的功能与 M2 型巨噬细胞相似，因此被认定为 M2d 亚。M2 型巨噬细胞的特征是：IL-12lowIL-23lowIL-10high，分泌 CCL17、GF-β，并高表达甘露糖受体（CD206）和半乳糖受体，但是抗原呈递能它的另一特点是精氨酸代谢发生变化：精氨酸转变为鸟氨酸和多胺，氨酸酶形成瓜氨酸和 NO[16-17]。所以，M2 型可参与调节宿主的炎症

巨噬细胞,微环境,甘露糖受体,清道夫受体

图 1.2 巨噬细胞的极化及其功能组织中的巨噬细胞来源于外周单核细胞，并在微环境的刺激下活化为 M1 型或者M1 型由 LPS 和 IFN-γ 激活，能够分泌大量的促炎因子，如 IL-6、IL-12、IL-23 和 TNM2 型根据刺激的不同分为 M2a、M2b、M2c 和 M2d 四种亚型。M2 型巨噬细胞可的 IL-10，并表达高水平的清道夫受体、甘露糖受体、IL-1 受体拮抗剂和 IL-1 诱M1 型巨噬细胞可驱动促炎反应和抗肿瘤反应，激活细胞毒性。与此相反，M2 型却促进血管生成、免疫抑制和肿瘤生长。LPS：脂多糖；IC：免疫复合物；GC：素；SR：清道夫受体；MR：甘露糖受体；IL-1ra：IL-1 受体拮抗剂；TLR：Toll MHC：主要组织相容性复合物。.4 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）循环系统中的单核细胞和寄居在组织中的巨噬细胞在趋化因子的作用下到肿瘤部位，从而形成肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。肿瘤组织中巨噬细胞的
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.3

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