MHC Ⅱ参与骨癌痛形成的机制研究

发布时间：2019-11-09 14:39

【摘要】：研究背景据国家癌症中心数据显示,2015年我国预计新增的恶性肿瘤病例达429.2万例,其中肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等高转移性恶性肿瘤发病比例较高。有报道指出75-90%进展期及终末期的癌症病人必须接受慢性疼痛治疗,其中骨癌痛是治疗的重要部分。骨癌痛常发生于原发性的骨骼恶性肿瘤或继发于前列腺癌、肺癌、乳腺癌等最常波及骨骼的高转移性肿瘤。当累及骨骼时,起初表现为钝性疼痛,逐渐进展为中至重度的持续痛并伴有爆发痛,严重影响患者的生活质量。随着诊疗技术的发展,癌症患者的生存率显著增加,因此恶性肿瘤导致的骨骼疼痛成为迫切需要解决的问题之一,然而骨癌痛的发病机制目前所知有限,极大地阻碍了对骨癌痛的有效治疗。研究发现,慢性疼痛的发生是以基因背景为基础,与个体所处客观环境相互作用的结果,其中的候选基因包括HLA。脊髓是慢性疼痛发生中枢敏化的关键部位,研究发现,主要组织相容性复合体II (Major Histocompatibility Class II, MHC II)高表达于慢性疼痛动物的脊髓背角,抑制该分子表达能够显著改善神经损伤导致的异常疼痛和痛觉超敏。据此推测MHC II可能是介导慢性疼痛中枢敏化的分子之一,然而该分子在骨癌痛发生中的作用目前所知甚少。JAK/STAT1信号通路执行细胞内的信号转导和转录激活两个方面的功能,在抗原递呈细胞内参与启动CIITA (MHC Class II Transactivator, CIITA)的转录,而CIITA又调控MHC II的表达,因此,JAK/STAT1信号通路是调控MHC II表达的重要因素,抑制该通路后有可能缓解骨癌痛症状。MEK/ERK信号通路是参与小胶质细胞激活的MAPK成员之一,主要执行小胶质细胞的增殖和促炎性介质的释放,研究指出,JAK/STAT1与MEK/ERK信号通路之间存在着相互联系,据此我们提出研究假说：脊髓背角小胶质细胞JAK/STAT1信号通路激活,通过调控CIITA的表达导致MHC II分子表达上调并参与骨癌痛的发生；此外,MEK/ERK信号通路与JAK/STAT1信号通路之间存在相互联系。研究方法与结果1 MHCⅡ参与骨癌痛发生方法实验一：选择健康成年雌性健康SD大鼠随机分为正常组、假手术组和骨癌痛组,建立骨癌痛大鼠模型,分别在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21d测定手术侧肢体的机械性缩爪阈值(Mechanical Paw Withdrawal Threshold, MPWT),利用Western blot和免疫荧光染色检测MHC II及其调控分子CIITA在脊髓的表达变化情况。实验二：建立骨癌痛大鼠动物模型,鞘内注射米诺环素或者脊髓微注射LV-Ciita-RNAi定向沉默CIITA,观察下调MHC II表达后大鼠疼痛行为的变化,免疫荧光染色观察慢病毒在脊髓背角的转染效果,RT-PCR验证LV-Ciita-RNAi沉默CIITA情况；选择LV-Ciita-RNAi及阴性对照慢病毒干扰的骨癌痛大鼠和正常大鼠,鞘内注射重组大鼠IFNy诱导MHC Ⅱ表达上调,并验证LV-Ciita-RNAi沉默CIITA的效果。Western blot检测干预后CIITA和MHC Ⅱ在脊髓的表达变化。结果骨癌痛组大鼠在模型建立后7、14和21 d表现为典型的异常疼痛,同时CIITA和MHC Ⅱ的蛋白表达水平显著上调。鞘内注射米诺环素或脊髓微注射LV-Ciita-RNAi均能够显著抑制MHC Ⅱ的表达上调,并明显改善骨癌痛症状。鞘内注射重组大鼠IFNy能诱导MHC Ⅱ在阴性对照病毒注射的骨癌痛大鼠和正常大鼠脊髓的表达上调,对LV-Ciita-RNAi干扰的骨癌痛大鼠无显著影响。2 JAK/STAT1和MEK/ERK信号通路激活并参与骨癌痛发生方法实验一：选择健康成年雌性SD大鼠随机分为正常组、假手术组和骨癌痛组,建立骨癌痛大鼠模型,分别在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21d测定手术侧肢体的MPWT,利用Western blot和免疫荧光染色检测pSTAT1和pERK在脊髓的表达变化情况。实验二：建立骨癌痛大鼠模型,鞘内注射JAK抑制剂AG490、STAT1抑制剂Fludarabine和MEK抑制剂U0126,每日1次；分别在模型建立前和建立后3、7、10和14 d观察手术侧肢体的MPWT;于手术后14d安乐死大鼠取脊髓腰膨大,利用Western blot检测pSTAT1、pERK、CIITA和MHCⅡ的表达变化。结果骨癌痛大鼠脊髓的pSTAT1和pERK的表达水平显著上调。鞘内注射Fludarbine和U0126能够显著地抑制pSTAT1、pERK、CIITA和MHCⅡ的表达上调,同时显著性地改善骨癌痛的MPWT下调,而AG490对上述作用有限。3 JAK/STAT1和MEK/ERK信号通路激活介导原代小胶质细胞MCHⅡ的表达方法体外培养出生24 h内大鼠大脑皮层的原代小胶质细胞,重组大鼠IFNy诱导JAK/STAT1和MEK/ERK信号通路激活；干预组在IFNy刺激前30 min分别加入AG490、Fludarabine和U0126,24 h后提取细胞总蛋白,利用Western blot检测pSTAT1、 pERK、CIITA和MHCⅡ蛋白表达水平的变化情况。结果IFNy能够显著地激活JAK/STAT1和MEK/ERK信号通路,同时导致CIITA和MHC II的表达显著上调；抑制剂Fludarabine或U0126分别显著抑制JAK/STAT1或MEK/ERK信号通路激活,但均能够抑制CIITA和MHC II的表达上调,其中U0126能够抑制STAT1的磷酸化激活,而Fludarabine对ERK的磷酸化水平无显著影响；AG490对上述通路激活的抑制作用相对有限。4统计分析数据处理采用SPSS 17.0软件进行分析,计量资料以x±SEM表示；两个变量之间比较采用独立样本t检验；多个变量的比较采用one-way ANOVA,组间行为学结果分析采用two-way ANOVA;统计结果的图片制作采用GraphPad prism 5, p 0.05认为差异具有统计学意义。研究总结1主要研究结果1.1骨癌痛大鼠脊髓MHC II表达上调,特异地表达于小胶质细胞；鞘内注射小胶质细胞抑制剂或脊髓微注射慢病毒定向沉默CIITA基因,能显著降低MHC II的表达水平,并显著改善大鼠的骨癌痛症状；1.2骨癌痛大鼠脊髓信号通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活,磷酸化激活性的pSTAT1和pERK表达于小胶质细胞和星形胶质细胞；鞘内注射抑制剂能显著抑制信号通路,并抑制MHC II的表达上调,同时显著缓解骨癌痛大鼠的痛觉异常；1.3重组大鼠IFNy刺激体外培养的大鼠原代小胶质细胞,能够激活信号通路JAK/STAT1和MEK/ERK,并诱导MHC II的表达水平上调；抑制信号通路激活能够显著抑制MHC II的表达。2研究结论2.1骨癌痛大鼠的脊髓小胶质细胞表达MHC II并介导骨癌痛发生；2.2 JAK/STAT1是调节MHC II表达的重要信号通路；2.3小胶质细胞的信号通路MEK/ERK对JAK/STAT1有单向调控作用。3创新之处3.1首次揭示了MCHⅡ分子在骨癌痛发生中的作用；3.2首次发现JAK/STAT1信号通路参与骨癌痛发生；3.3揭示了骨癌痛病理情况下,小胶质细胞的信号通路MEK/ERK对JAK/STAT1的单向调控作用。4展望4.1本研究发现MHC II表达于骨癌痛大鼠脊髓的小胶质细胞,可能是骨癌痛治疗的新靶点,然而MHC II分子是否参与抗原递呈功能并诱导外周的CD4+T细胞迁移进入中枢神经系统,二者相互作用导致脊髓的神经炎症反应,进而参与骨癌痛病理过程目前仍然不明确,需要在将来的工作中进一步研究；4.2该研究证实小胶质细胞的信号通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活,诱导MHC Ⅱ表达并参与骨癌痛发生,揭示了骨癌痛形成的信号通路调控机制,然而上述信号通路介导的生物学功能复杂,二者之间存在密切联系,在揭示其参与骨癌痛发生的机制方面仍然需要更深入的研究；此外,诱导信号通路激活的上游信号分子亦需要进一步阐明。
【图文】：

大鼠,侧足,骨癌,痛觉过敏

中科技大学博去学位论文逡逑结果逡逑腔内种植Ｗａｌｋｅｒ邋２５６乳腺癌细胞成功建立骨癌痛大鼠动物模的测定结果显示，ＢＣＰ组大鼠在手术后７邋ｄ手术侧的ＭＰＷＴ基础值１０．７８邋±化４２邋ｇ，且呈现时间依赖性地持续降低，２１邋ｄ．５６邋ｇ，发展为典型的痛觉过敏；Ｓｈａｍ组大鼠各时间点的ＭＰＷＴ变化（国１）。该结果说明大鼠腔骨骨髓腔接种Ｗａｌｋｅｒ邋２％乳低，发展为痛觉过敏，符合骨癌痛的典型表现。逡逑

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性破坏进一步加重，腔骨近端骨哶分离，有明显的骨折线；２１邋ｄ时由于皮质骨的破坏，逡逑Ｗａｌｋｅｒ邋２％s侔┫赴ド⒅燎还枪撬枨煌猓⑸菩陨ぃ逦杉那还乔叭礤义蟷D织影像面积显著增加，同时溶骨性破坏及病理性骨折进一步发展（图２）。这些结逡逑果说明腔骨骨髓腔内种植Ｗａｌｋｅｒ邋２５６乳腺癌细胞导致时间依赖性的溶骨性骨骼破坏，逡逑诱发病理性骨折，符合骨癌痛患者的病理发展过程。逡逑ｍ拍逡逑图２．大鼠右侧腔骨Ｘ线平片检查结果逡逑Ｘ线平片显示ＢＣＰ组大鼠手术侧腔骨近端的骨骼呈进行性破坏，骨密度降低伴有病理性逡逑骨折（红色箭头所示部位），２１邋ｄ时肿瘤突破骨髓腔转移至周围软组织；Ｎａｉｖｅ组和Ｓｈａｍ组逡逑２１邋ｄ大鼠骨骼无显著性改变。Ｘ线曝光参数：管电压４５？５０邋ｋＶｐ，，曝光时间５？１０邋ｍＡｓ。标逡逑尺＝１邋ｃｍ。逡逑大鼠安乐死后右侧腔骨取材，剥除骨骼表面软组织结构，肉眼观察腔骨近端的大逡逑体标本，发现ＢＣＰ组大鼠１４邋ｄ和２１邋ｄ时骨骼的外侧皮质表面凹凸不平，呈现虫蚀样逡逑外观
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738

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