大肠癌细胞与成纤维细胞相互作用体外模型建立及相关功能研究
发布时间：2019-11-12 04:04
【摘要】：1、背景：根据世界卫生组织相关报道,肿瘤已经超越心血管疾病成为世界上首要致死疾病。已有大量研究致力于阐明肿瘤发生发展机制,为肿瘤诊断及治疗提供依据。近年来,肿瘤微环境这个重要概念的提出促进了靶向肿瘤基质的新型治疗方法的出现。尤其是成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等能够促进肿瘤生长的间质成分,越来越成为肿瘤治疗的重要目标。肿瘤微环境是由肿瘤细胞及细胞外间质相互作用所形成的特殊环境,细胞外间质成分包括成纤维细胞、炎症细胞,血管内皮细胞,血管周细胞,间充质干细胞,细胞外基质及多种细胞因子,其中,肿瘤相关成纤维细胞是微环境中的主要间质成分。肿瘤相关成纤维细胞最常见的标志物是a-SMA,但是仅仅通过a-SMA检测不足以鉴定CAFs[10,19,20],其他广泛应用的CAFs标志物还包括成纤维细胞特异性蛋白(FSP),成纤维细胞激活蛋白(FAP),血小板衍化生长因子受体a/β(PDGFRa/β)[14,。FSP调控细胞周期、参与维持完整的细胞骨架,其异常表达能够促进肿瘤的生长、增殖、转移。FAP特异性表达于血管周细胞以及创伤修复过程中及肿瘤间质中的活化成纤维细胞。FAP在90%的实体肿瘤中可被激活。在人类90%肿瘤中可以检测到PDGFRa/β[13]。不同类型肿瘤中的CAFs具有高度异质性,其来源尚有争议,可能来源于宿主间质成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞以及骨髓间质干细胞等。许多体内外实验的均已证实CAFs能分泌生长因子促进肿瘤的生长及转移。由于CAFs是肿瘤间质中的主要细胞类型又具有促瘤作用,靶向CAFs的药物治疗手段越来越受到人们的重视。因此,我们此项研究致力于在体外环境下模拟正常成纤维细胞的活化过程,并探讨在此过程中肿瘤细胞及成纤维细胞的性状各发生何种变化。2、研究方法2.1光镜下观察小鼠胚胎来源的成纤维细胞在共培养前和共培养30d后形态变化,并通过细胞免疫荧光鉴定该成纤维细胞的来源。2.2将小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3与小鼠结肠癌细胞系CT26进行体外间接共培养,将共培养3d、6d、9d、12d、15d的成纤维细胞与未经处理的NFs细胞,行a-SMA蛋白荧光染色,以lOng/ml重组人TGF-β作用72h的成纤维细胞作为活化成纤维细胞的标准,比较共培养不同时间的成纤维细胞的活化程度的变化。2.3采用a-SMA、FAP、FSP1、PDGFRa/(3作为活化成纤维细胞特异性标志物,比较共培养后正常成纤维细胞上述蛋白表达水平变化。取共培养Od、3d、6d、9d、 12d.15d、30d的成纤维细胞做Western blot检测,以单独培养的经过相同传代次数的NFs作为阴性对照组,以lOng/ml重组人TGF-β作用NFs 72h作为阳性对照。2.4收集共培养Od.6d、15d.30d的大肠癌细胞CT26消化离心,2%血清培养基重悬细胞作为实验组,对照组用2%血清培养液重悬未经过共培养但经过相同传代次数的普通CT26细胞,配制细胞悬液浓度为5×105/ml,向transwell小室的上室中加入200μ1单细胞悬液,向transwell小室的下室中加10%血清浓度的培养液600u1。放入细胞培养箱12h后,取出小室,进行HE染色,显微镜下观察穿过的肿瘤细胞。2.5将共培养15d、30d及普通培养但经过相同传代次数的CT26细胞分别进行划痕实验,分别在Oh、6h、12h、24h镜下观察,并拍照,将照片上传wimasis.com网站进行数据分析每个时间点肿瘤细胞覆盖面积。2.6取普通培养的CT26细胞按30万/孔种六孔板作为对照组,隔天加药,分别是顺铂(0.10.20.40.80.160umol/1)；奥沙利铂(0.20.40.80.160.320umol/1);氟尿吡啶(0.10.20.40.80.160umol/l)；伊立替康(0、20.40.80.160. 320umol/l)。药物作用24h后,胰酶消化,离心、重悬、台盼蓝染色、计数、计算不同药物不同浓度作用下CT26细胞的存活率,每种药物至少重复三次。选取经过共培养30d的CT26细胞重复上述实验。2.7收集与大肠癌细胞CT26间接共培养30d的成纤维细胞作为实验组,培养相同时间并经历相同传代次数的正常成纤维细胞作为对照组,分别从细胞中提取总RNA,利用microRNA芯片技术对其进行分析,筛选出表达差异谱。3、结果：3.1经共培养后,成纤维细胞形态未发生明显改变。通过细胞免疫荧光鉴定本研究培养的成纤维细胞,结果提示Vimentin(+).α-SMA部分(+)、Pan cytokeratin(-). Desmin(-),提示该细胞为间质成分来源且成分较为均一。3.2随着共培养时间的延长α-SMA阳性细胞比例显著升高,且表达增强,同时细胞骨架变大变宽,表明正常成纤维细胞向肌源性成纤维细胞即活化成纤维细胞转化,当共培养时间达到15d左右,成纤维细胞达到活化状态。3.3随着共培养时间的延长,成纤维细胞中α-SMA、FAP.FSP.PDGFRβ的表达水平逐渐升高,共培养2w左右,成纤维细胞上述蛋白的表达水平已达到与阳性对照组相当水平,结合之前免疫细胞化学结果,我们可以判断,共培养15d左右,成纤维细胞达到活化状态。3.4未经过共培养的CT26细胞12h后几乎没有细胞穿过8.0um聚碳酸酯膜,共培养6d、15d、30d的肿瘤细胞穿过聚碳酸酯膜的数目逐渐增多,结果表明,随着共培养时间的增加,肿瘤细胞转移能力增强。3.5在Oh,三组肿瘤细胞(共培养30d、共培养15d、共培养Od)覆盖面积分别为62.9%、62.6%、62.2%,无统计学差异；在6h,三组肿瘤细胞(共培养30d、共培养15d、共培养0d)覆盖面积分别为71.6%、67.3%、65.5%；在12h,三组肿瘤细胞(共培养30d、共培养15d、共培养0d)覆盖面积分别为88%、81.3%、68%；在24h,三组细胞(共培养30d、共培养15d、共培养0d)覆盖面积分别为99.3%、91%、76.6%。由此可见,在6h、12h以及24h,经过共培养的肿瘤细胞覆盖面积均大于普通培养的肿瘤细胞,且在每个检测时间点共培养30d的肿瘤细胞覆盖面积最大,24h后细胞覆盖面积达99.3%。3.6普通培养及共培养30d的肿瘤细胞在顺铂、奥沙利铂、氟尿嘧啶、伊立替康四种常用化疗药物的作用下,存活率都降低,但两组细胞的存活率无明显差异。3.7使用Aligent microRNA专用软件分析扫描图像所得数据,分别计算出两种样本中microRNA的标准值及比值。判断标准：实验组与对照组表达量比值2为表达上调,0.5则为表达下调,筛选出一组表达量上调及一组表达量下调的microRNA。4、结论4.1 CT26细胞株可以活化正常成纤维细胞,并且不依赖细胞之间的相互接触；4.2成纤维细胞的活化状态对CT26细胞迁移和侵袭有重要影响,但经共培养的CT26细胞对常见大肠癌化疗药物的耐药性变化不大；4.3通过对肿瘤相关成纤维细胞microRNA的研究,可探讨CAFs中micro RNA分子的调控对抗肿瘤转移的影响。
【图文】：
殖、生长、浸润，肿瘤细胞必须与它周围的环境因素起协同作用，这一假说为＂肿逡逑瘤微环境＂的提出奠定了基础Ｅ２５３。肿瘤微环境由多种细胞成分及因子组成的特殊逡逑环境，为肿瘤的增殖浸润等生物学行为提供了不可或缺物质基础（图２），，因此肿逡逑瘤微环境局部缺氧及酸性状态与肿瘤血管的异常增殖，遁透性增加，及糖酵解代逡逑谢增强有关ｕａ。关于ＣＡＦｓ促进脚瘤发生发展的相关机制可Ｗ大致归纳为；ＣＡＦｓ通逡逑过分泌趋化因子、生长因子、基质金属蛋白路从而促进血管生成和基庇膜破坏，逡逑使肿瘤细胞的转移能力增强逡逑肿瘤基质中活化的成纤维细胞被称作肿瘤相关成纤维细胞（ｃａｎｃｅｒ逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｆ化ｒｏｂｌａｓｔｓ，邋ＣＡＦｓ），又称肌纤维母细胞。在大多数实体肿瘤中，肿逡逑瘤相关成纤维细胞的数量占了肿瘤间质细胞的绝大部分。虽然目前尚无可靠研究逡逑证实肿瘤成纤维细胞的来源，这一领域化饱受争议，但是ＣＡＦｓ在巧瘤微环境中表逡逑达多种细胞因子、枯附因子、虽白w龋庑┥镆蛴谕ü嘀滞揪洞俳装┑腻义涎苌桑琢龅纳ぴ鲋臣敖笄ㄒ啤Ｖ琢鱿喙爻上宋赴俳琢龇⑸⒄瑰义系幕颇壳吧胁磺宄写诟徊降难芯俊Ｄ壳埃醒芯勘砻鳎祝茫粒疲蟛义匣式到饷父谋湎赴饣式峁勾佣俳琢鱿赴窒妥
本文编号：2559580
【图文】：
殖、生长、浸润，肿瘤细胞必须与它周围的环境因素起协同作用，这一假说为＂肿逡逑瘤微环境＂的提出奠定了基础Ｅ２５３。肿瘤微环境由多种细胞成分及因子组成的特殊逡逑环境，为肿瘤的增殖浸润等生物学行为提供了不可或缺物质基础（图２），，因此肿逡逑瘤微环境局部缺氧及酸性状态与肿瘤血管的异常增殖，遁透性增加，及糖酵解代逡逑谢增强有关ｕａ。关于ＣＡＦｓ促进脚瘤发生发展的相关机制可Ｗ大致归纳为；ＣＡＦｓ通逡逑过分泌趋化因子、生长因子、基质金属蛋白路从而促进血管生成和基庇膜破坏，逡逑使肿瘤细胞的转移能力增强逡逑肿瘤基质中活化的成纤维细胞被称作肿瘤相关成纤维细胞（ｃａｎｃｅｒ逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｆ化ｒｏｂｌａｓｔｓ，邋ＣＡＦｓ），又称肌纤维母细胞。在大多数实体肿瘤中，肿逡逑瘤相关成纤维细胞的数量占了肿瘤间质细胞的绝大部分。虽然目前尚无可靠研究逡逑证实肿瘤成纤维细胞的来源，这一领域化饱受争议，但是ＣＡＦｓ在巧瘤微环境中表逡逑达多种细胞因子、枯附因子、虽白w龋庑┥镆蛴谕ü嘀滞揪洞俳装┑腻义涎苌桑琢龅纳ぴ鲋臣敖笄ㄒ啤Ｖ琢鱿喙爻上宋赴俳琢龇⑸⒄瑰义系幕颇壳吧胁磺宄写诟徊降难芯俊Ｄ壳埃醒芯勘砻鳎祝茫粒疲蟛义匣式到饷父谋湎赴饣式峁勾佣俳琢鱿赴窒妥
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