CIK诱导过程中TCR的表达变化及靶向TCR的基因编辑研究

发布时间：2019-11-12 05:50

【摘要】：目的:通过分析T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)分子在CIK诱导过程中的表达变化情况,以及TCR基因的修饰或缺失是否影响CIK的杀伤活性,分析CIK中TCR分子是否发挥了功能,为以后基于CIK的特异性TCR基因修饰用于靶向治疗肿瘤的研究奠定基础。方法:一、CIK细胞培养过程中TCR表达谱的变化研究采集健康志愿者外周血,Ficoll法分离单个核细胞,按照CIK诱导方法完成对CIK细胞的诱导培养,并在0天、7天和14天分别取样,经过流式分选不同表型细胞,分别提取总RNA,经过逆转录,多重PCR扩增,然后利用Ge XP多重基因分析系统分析各组样品中22个TCRVβ亚家族的CDR3长度和谱型,并利用内参GAPDH平衡各组之间的差异,计算出各TCRVβ亚家族的表达量,分析不同时间以及不同组之间的差异变化。二、CIK细胞转染特异性TCR后杀伤功能的检测扩增survivin抗原肽优势取用基因TCR Vα4、Vβ7的重组腺病毒Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7,病毒滴度测定,按MOI比为1:20感染培养7天的CIK细胞,感染48小时,以30:1的效靶比杀伤四种不同肿瘤细胞系,对比感染前后杀伤功能的变化。三、7402-TCR-YFP稳转系的建立构建c DNA3.1-TCR-YFP质粒,经过线性化酶切,转染处于对数增殖期的7402细胞系,经过G418筛选,初步建立稳定表达细胞系,然后经单克隆筛选,建立7402-TCR-YFP单克隆细胞系。四、CRISPR-Cas9-TCRBC敲除质粒的构建及其功能验证利用CRISPR网站提供的靶向编辑位点筛选工具,设计出3个敲除位点,并针对这三个位点构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,其中包括不带荧光的PX330和带有GFP的PX458质粒,并用构建好的质粒转染稳转的7402细胞系、常规Hep G2细胞系,通过流式细胞术结合PCR、T-A克隆测序等方法验证CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒的功能。结果:一、CIK诱导培养之后TCR表达谱并未发生太大变化。利用Ge XP多重基因分析系统完成对0天CD3+T、CD3+CD8+T、CD3+CD4+T,7天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T以及14天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T细胞群的TCRVβCDR3表达谱的研究工作。从整体水平上看,随着培养时间的延长,TCR表达谱并未出现较大偏移,每个家族都呈现出典型的多克隆钟形分布,只有0天在T细胞中检测到寡克隆表达的Vβ8和Vβ16家族,选择性的在CD3+CD56+T细胞群中出现较高表达,而没有在CD3+CD56-T细胞群中出现单克隆性高表达,并且在Vβ16在CD3+CD56+细胞群中的比例高于初始CD3+CD8+T细胞中的比例。二、转Survivin特异性TCR的CIK细胞对HLA-A2+Survivin+肿瘤细胞有显著增强成功扩增Survivin特意性的Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7重组腺病毒,以MOI比为1:20感染培养7天的CIK细胞,48小时后,用TCRBV7抗体检测转染后CIK细胞阳性率为9.7%(对照组为4.5%),钙黄绿素释放法检测转染后的CIK细胞对7402、Hep G2、MCF-7、H1299四种靶细胞杀伤效率,发现CIK细胞转染Survivn特异性TCR基因后,对Hep G2(HLA-A2+、Survivin+)和MCF-7(HLA-A2+、Survivin+)杀伤效果大大增强,然而对于肝癌细胞株7402(HLA-A2-、Survivin+)和H1299(HLA-A2-、Survivin-)的杀伤能力却并没有明显增强效果。三、成功构建7402-TCR-YFP稳转细胞系成功构建7402-TCR-YFP稳转细胞系,并通过单克隆培养,建立单克隆细胞系流式检测YFP荧光效率为70%。四、成功构建CRISPR-Cas9-TCRBC质粒,并完成功能验证针对设计的3个靶位点成功构建出,PX330和PX458两种敲除质粒,用三种质粒转染稳转7402细胞系,发现S位点敲除效率最高,转染5天流式检测7402稳转系荧光率从75%下降到35%。然后利用PX458-S质粒转染Hep G2细胞系,流式检测转染效率为22.4%,然后提取基因组DNA,通过PCR,T-A克隆测序,在20个单克隆中有4个发生插入,且插入碱基均为单一A碱基,插入位点均为PAM位点上游第4个碱基处,整体突变率为20%,相对于转染成功的细胞比例22.4%,有效编辑率约为89.2%。结论:成功建立CIK细胞不同天数、不同亚群的TCRVβ表达谱,通过对比发现,在培养过程中,绝大多数表达谱没有发生偏移,但是对于有些特异性的T细胞,却出现了分布的差异性。成功扩增Survivin特异性重组腺病毒,转染CIK,杀伤实验初步证明了CIK细胞中TCR的作用。成功构建7402-TCR-YFP稳转细胞系,成功构建出CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,并证明CRISPR-Cas9-S具有最高的位点识别和敲除效率。
【图文】：

广东药学院硕士研究生毕业论文1.3.3 多重 PCR 扩增 TCRVβ 片段 CDR3 区电泳结果各样品经多重 PCR 反应后，条带相互之间间隔清晰，并且条带位置与目的大小相符，，表明特异性较好，可进行下一步 GEXP 上机检测。如图 1-1 所示，为 7 天、14 天和 0 天部分细胞群电泳图。AA

天、14天CD3+C56+细胞群对比0天CD3+CD8+细胞群TCR表达谱峰型结
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer(CIK)cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期

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1 王腾;GeXP多基因遗传表达系统检测人TCRVα和TCRVβ链CDR3谱型及长度的方法建立以及初步应用[D];广东药学院;2013年

本文编号：2559627