miR-204-5p抑制非小细胞肺癌生长的作用及分子机制研究

发布时间：2019-11-16 11:56

【摘要】：背景：肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。由于肺癌病人早期症状不典型,同时缺乏敏感的筛查指标及有效的确诊方法,大多数患者就诊时已处于中晚期,因此失去手术治疗的机会；放疗化疗毒副作用较大,不能高度特异性地杀伤肿瘤细胞；此外由于肺癌容易复发和远处转移,即使在肿瘤完全切除的情况下肺癌患者大多也会死于复发和转移。肺癌的预后难以评估,同一分期、同一组织学类型、采用同一治疗方案的肺癌患者,其治疗效果和远期生存情况会有明显不同。当前国际广泛采用的肺癌TNM分期存在诸多不足,尤其是对于开展肺癌患者个体化的治疗及预后评估等发挥的作用极为有限。近年来,有关microRNA (miRNA)与肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展、诊断治疗的关系备受关注。微小RNA是由约22个核苷酸组成的非编码、小分子单链RNA；具有较高的保守性,几乎存在于所有的真核细胞。深入研究miRNAs在肿瘤发生发展中的作用,将为肺癌的诊治提供新的方案和新的靶点。目的：在非小细胞肺癌患者手术切除的肿瘤标本和癌旁标本组织中用Real Time PCR方法检测miR-204-5p的表达情况。体外实验中根据一系列实验方法鉴定miR-204-5p在肺癌A549和HCC827细胞株中的生物学功能。通过信息学预测软件对miR-204-5p作用靶点进行预测,并用生物学功能实验加以验证。方法：1.在30对配对的肺癌和癌旁组织标本中检测miR-204-5p的相对表达量,对肺癌组织及对照的癌旁组织中miR-204-5p的表达差异进行统计,并分析不同病理分期的肺癌中miR-204-5p的表达情况；2.在BEAS-2B和肺癌细胞A549. HCC827细胞检测miR-204-5p的相对表达量。对肺癌A549和HCC827细胞株进行转染miR-204-5p mimic使细胞过表达miR-204-5p,然后进行相关功能学的实验检测。通过CCK-8、平板克隆形成、流式细胞周期检测和流式细胞凋亡检测、划痕愈合实验和Transwell小室法等方法分析上调miR-204-5p表达后对细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移侵袭等能力的影响；3. miR-204-5p的靶基因通过在线软件进行预测,然后通过Real Time PCR, Western Blot等方法验证靶基因mRNA及蛋白表达量是否发生变化。并用荧光素酶双报告系统对miR-204-5p的靶序列进行鉴定；应用拯救实验(Rescue实验)进一步验证miR-204-5p作用的靶基因。结果：1.收集的30对肺癌和癌旁组织标本中,有27例miR-204-5p相对低表达,比例占90%。癌组织中miR-204-5p表达量平均约癌旁组织的1/2。高分期肺癌与低分期肺癌在miR-204-5p的相对表达量的平均值有差异,但未能有统计学上的显著性意义。2与正常肺组织上皮细胞株BEAS-2B相比,肺癌A549和HCC827细胞株中miR-204-5p呈现为低表达的状态。体外转染miR-204-5p至肺癌A549和HCC827细胞株使miR-204-5p过表达：50nM浓度可以抑制细胞增殖活力；体外平板克隆形成实验表现为抑制细胞克隆形成；细胞周期实验出现G1期阻滞。划痕愈合实验和Transwell小室等实验显示miR-204-5p过表达未能显著减弱A549和HCC827细胞的迁移和细胞侵袭能力,对细胞凋亡无明显影响。3.通过在线软件的预测,分析CCND1可能是miR-204-5p靶基因,通过Real Time PCR和Western Blot实验检测发现在过表达miR-204-5p后靶基因CCND1的mRNA水平和蛋白质水平都显著下调。荧光素酶双报告系统结果证实CCND1是miR-204-5p的直接作用靶点,miR-204-5p调控的作用序列存在于其3'-UTR中。结论：肺癌组织中miR-204-5p是一个抑癌基因,miR-204-5p可以通过靶基因CCND1抑制A549细胞和HCC827细胞的增殖能力。
【图文】：

图１．３．２邋３０例肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ表达量（Ｗ内参Ｕ６参比）。肺癌组织中逡逑ｍｉＲ－２０４－５ｐ相对表达量要显著化于癌旁正常组织（＊：ｔ检验，Ｐ＜０．０５）逡逑．瓜－－

令於逦。々逡逑图１．３．２邋３０例肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ表达量（Ｗ内参Ｕ６参比）。肺癌组织中逡逑ｍｉＲ－２０４－５ｐ相对表达量要显著化于癌旁正常组织（＊：ｔ检验，Ｐ＜０．０５）逡逑１．３．３不同分期的肺癌中ｍ瓜－２０４－５ｐ的表达情况逡逑在３０例肺癌标本中，根据病理Ｔ和Ｎ分期将标本进行分组，，其中Ｔ１期肺癌逡逑１７例，Ｔ２期及Ｗ上肺癌１３例；其中ＮＯ期肺癌８例，Ｎ１期及Ｗ上肺癌２２例。不逡逑同分期的肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ的相对表达量如表１．３．３所示，经Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎ巧检验逡逑未发现有显著性差异（表１．３．３、图１．３．３和图１．３．４）。逡逑表１．３．３不同病理分期的肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ的相对表达量逡逑临床指标分期（Ｔ）逦ｍｉＲ－２０４－５ｐ相对表达量逦Ｐｉｔ＊逡逑Ｔ分期逦０．６３０逡逑Ｔ１邋期逦１７逦０．５％±０．３５２７逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：2561825