结直肠癌细胞同期放化疗抵抗关键调控基因的筛选

发布时间：2019-11-24 12:51

【摘要】：[目的]：据统计,结直肠癌每年有100多万例新发病例¨。新辅助放化疗在直肠癌患者治疗中起重要作用。随着新辅助放化疗运用的日趋广泛,放化疗抵抗的问题也日趋凸显。研究显示,基因表达异常可能导致以5-Fu为基础的同期放化疗抵抗。本项目通过构建直肠癌细胞体外同期放化疗模型,诱导结直肠癌放化疗抵抗细胞株,并运用全基因组表达谱芯片全面对比野生型结直肠癌细胞和所诱导的同期放化疗抵抗细胞株的基因差异,筛选结直肠癌细胞同期放化疗抵抗的关键基因,以全面了解结直肠癌同期放化疗抵抗机制。本项目将为进一步探索合理的干预措施以逆转直肠癌放化疗抵抗打下基础,并为临床提供放化疗疗效提供理论依据。[方法]：1.采用10μmol/15-Fu及4Gy 6MV X-ray对人结直肠癌细胞HCT116进行体外同期放化疗,建立体外同期放化疗抵抗人结直肠癌HCT116细胞株(chemoradioresistant cell, CRR cell);2. Clongenic Survival Assay法检测同期放化疗后HCT116细胞株的同期放化疗抵抗性；3.全基因组表达谱芯片检测同期放化疗抵抗HCT116与其母细胞mRNA表达水平的差异；4.差异性表达mRNAs进行GO (gene ontology)分类,探索其生物学功能；5. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析与差异性表达基因相关的信号通路；6.随机选择6个差异性表达基因进行qRT-PCR验证其mnRNA表达水平；7.数据统计和分析采用SPSS17.0软件包进行,数据以均数士标准差(x±s)表示,组间资料应用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)和t检验。[结果1：1.经过10次体外同期放化疗后,已建立同期放化疗后HCT116残癌细胞株；2. Clongenic Survival Assay法证实同期放化疗后HCT116残癌细胞株具有同期放化疗抵抗性,为同期放化疗抵抗细胞株；3.全基因组表达谱芯片共筛选了21811个mRNAs,以fold change 2为差异性表达基因筛选标准,其中11.0%(2397/21811) mRNAs在HCT116 CRR细胞和HCT116母细胞中表达有差异；4.按GO生物学过程(Biological process),细胞构成(Cellular component),分子功能(Molecular function)对差异性表达基因进行分类,发现差异性表达基因具有多种生物学功能；5. KEGG信号通路分析与差异性表达基因相关的信号通路,有57条信号通路(38条上调,19条下调)与差异性表达基因相关；6. qRT-PCR验证中,随机选择的6个差异性表达基因中,除HOXB7外,其余5个基因的mRNAs上调、下调趋势与基因芯片结果相同。[结论]：1.本实验证实体外应用模拟临床结直肠癌治疗的大剂量冲击法可以增加人结直肠癌细胞HCT116的放化疗抵抗性。成功建立放化疗抵抗人结直肠癌细胞HCT116,为结直肠癌放化疗抵抗性的研究进一步奠定了基础。2.结直肠癌放化疗抵抗相关mRNA差异表达谱的建立,综合信息学分析提供了数个可能的富集生物过程和富集通路,为后续的研究提供了研究的方向和依据。3.qRT-PCR检测部分基因表达情况,与基因芯片结果大部分一致,提示基因芯片结果准确可靠。
【图文】：

细胞存活曲线,细胞存活曲线,模型拟合,放化疗

２．邋Ｃｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ对放化疗后残癌细胞株的放化疗抵抗性鉴定结果逡逑Ｇｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ结果槰示ＨＣＴ１１６野生型细胞株克枦形成数明．思少逡逑于ＨＣＴ］１６ＣＲ民细胞（图２），多视单击模型拟合细胞存活曲线（图３），实验逡逑}DＤｑ、Ｄｏ、ＳＦ２明虽低于照射组（表１）。逡逑Ｒａｄｉａｔｉｏｎ邋Ｄｏｓｅ邋（Ｇｙ）邋０逦２逦４逦?逦８逦１０逡逑庐冷．Ｖ邋：．逦．逡逑ＣＲＲＨＣＴ＂ｅＣｅ＂之：学女）‘？车．户‘逦ｙ．逡逑若；？邋；邋＇邋？如＇．‘．，－逡逑．＊＊？＞．＊，逡逑Ｐａｒｅｎｔａｌ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃｅｌｌ邋ｆ．逡逑罔２；邋Ｃｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ法鉴定细胞放化疗抵抗性逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｒｅｓｉ邋巧邋ａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃ邋民民邋ｃｅＵ邋ｂｙ逡逑Ｃｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ逡逑１邋广＂？Ｉ逦？邋ＣＲＲ邋ＨＣＴ１１＃rP茫澹欤欤]3?0邋Ｐａ巧ｎｔａｌ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃｅｌｌ逡逑置逦＊逡逑0＞邋．０１邋Ｉ逦＊逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑＞逦＊逡逑Ｉ邋．００１逡逑（／）逡逑．０００１逦逦？逦■逦逦逦逦逦ｉ逡逑０逦２逦４逦６逦８逦１０逡逑Ｄｏｓｅ邋（Ｇｙ）逡逑图３：单击多魄模型拟合细胞存活曲线逡逑Ｆｉｇ．３邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｃｕｒｖｅ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｂｙ邋化ｅ邋ｍｕｌｔｉ－ｔａｒｇｅｔ，邋ｓｉｎTB］ｅ－ｈｉｔ邋ｍｏｄｅｌ逡逑＊各组细胞存活分数比

甲醛,凝胶电泳,纯度,母细胞

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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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