南蛇藤提取物调控HSP27抑制胃癌上皮间质转化的作用及机制研究
发布时间：2019-11-28 03:13
【摘要】：胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,是严重危害我国人民健康的重大疾病之一。由于早期症状不典型,确诊时多处于中晚期,转移率高、预后差、化疗敏感性低,是制约胃癌患者提高生存率的重要因素。目前认为上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是包括胃癌在内的多种来源于上皮细胞的恶性肿瘤获得侵袭转移能力的重要生物学过程,已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点。开发能够抑制胃癌EMT的抗肿瘤新药,对于防治胃癌的转移,改善患者预后具有重要的意义。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)为卫矛科南蛇藤属落叶木质藤本植物,是我国重要的药用植物,其茎、根、叶和果均可入药,具有祛风除湿、通经止痛、活血解毒等功效。近年来,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C. orbiculatus ethyl acetate extract, COE)的抗肿瘤作用已被广泛证实,但以往的研究多集中在调节肿瘤细胞增殖、凋亡,抑制肿瘤血管生成、侵袭转移等方面,关于针对其在肿瘤EMT方面的研究甚少。课题组前期研究发现COE可以抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力,然而COE是否具有抑制胃癌EMT发生的作用及其确切机制尚不清楚。本课题主要在前期研究的基础,利用转录生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导胃癌SGC-7901细胞发生EMT过程,建立EMT模型。研究COE对TGF-β1诱导的胃癌细胞EMT发生的抑制作用及其可能的分子机制。建立裸鼠胃癌皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型,研究COE在体内对胃癌生长、转移的影响及分子机制。通过本课题的研究,进一步阐明了COE抑制胃癌EMT的作用及相关分子机制,为开发新型抗胃癌药物提供新的策略和理论依据。本课题共分为三部分研究内容。第一部分南蛇藤提取物抑制胃癌SGC-7901细胞上皮间质转化的发生目的：观察COE对TGF-β1诱导的胃癌SGC-7901细胞EMT发生的影响；并对SGC-7901细胞在COE处理前后的样本进行差异蛋白质组学分析,寻找COE抑制胃癌EMT发生的可能作用靶点。方法：体外培养人胃癌SGC-7901细胞,给予不同浓度(2.5,5, 10ng/mL)的TGF-β1诱导24 h后,观察其形态变化,并采用Western blot技术检测TGF-β1对SGC-7901细胞EMT的影响,以确定建立EMT模型时TGF-β1的最佳浓度。不同浓度(10,20,40,80,160,320μg/mL)的COE对作用于SGC-7901细胞24 h后,MTT法检测COE对细胞生长增殖的影响,以确定后续实验中COE的浓度。不同浓度(5,10,20μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24 h后,Western blot和Transwell小室实验分别检测细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达以及细胞侵袭、迁移能力的变化,从而明确COE对胃癌细胞EMT发生的抑制作用。COE (20 μg/mL)作用TGF-β1 (10ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24 h后,蛋白质组学技术分析COE作用前后蛋白质组表达的差异,并对差异表达蛋白点进行质谱鉴定。结果：不同浓度(2.5,5, 10ng/mL)的TGF-β1诱导SGC-7901细胞24h后,细胞形态发生梭形改变;E-cadherin的表达下调,N-cadherin和Vimentin的表达上调；当TGF-β1浓度为10ng/mL时,变化效果最显著(P0.001)。不同浓度(10,20,40,80,160, 320μg/mL)的COE作用SGC-7901细胞24 h后,细胞的生长呈现不同程度的抑制,并呈一定的浓度依赖性；当COE浓度20时,对细胞的增殖无影响(P0.05)。不同浓度(5,10,20μg/mL)的COE作用TGF-β1 (10ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24h后,随着COE浓度的增加,细胞逐渐恢复成卵石状不典型上皮形态,且E-cadherin表达逐渐上调,N-cadherin和Vimentin表达逐渐下调,细胞的侵袭和迁移能力也逐渐降低,提示COE可以抑制TGF-β1诱导的SGC-7901细胞EMT的发生。蛋白质组学实验的结果表明,与对照组相比,在TGF-β1组表达上调,且在COE组中表达下调的差异蛋白点共4个；通过质谱分析鉴定为热休克蛋白27 (heat shock protein 27, HSP27)、抗增殖蛋白(Prohibitin)、丝切蛋白(Cofilin-1)、膜联蛋白A5(Annexin A5)。结论：COE可以抑制TGF-β1诱导的胃癌SGC-7901细胞EMT的发生,其作用机制可能是HSP27、Prohibitin、Cofilin-1、Annexin A5等靶点蛋白共同参与的结果。第二部分HSP27在南蛇藤提取物抑制上皮间质转化和调控NF-κB/Snail信号通路中的作用目的：以HSP27为研究切入点,探讨HSP27在COE抑制TGF-β1诱导的SGC-7901细胞EMT发生中的作用,以及HSP27在COE对肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)/Snail信号通路调节中的作用。方法：不同浓度(5,10,20 μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10 ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24 h后,Western blot和实时荧光定量PCR技术分别检测细胞中HSP27蛋白及mRNA表达水平的变化,以探讨COE对SGC-7901细胞HSP27基因表达的影响。COE(20μg/mL)和蛋白酶体抑制剂MG132 (1 μM)共同作用于TGF-β1诱导的SGC-7901细胞24 h后,Western blot技术检测细胞中HSP27蛋白表达的变化,以明确COE降解HSP27蛋白的可能途径。构建重组逆转录病毒载体MIGR1-HSP27,将其转染SGC-7901细胞,筛选逆转录病毒细胞株SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27, Western blot技术探讨HSP27是否具有调节胃癌细胞EMT发生的作用。COE (20μg/mL)作用于TGF-β1 (10 ng/mL)诱导的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞24 h后,Western blot和Transwell小室实验分别检测上述两种细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、 Vimentin)表达的水平和细胞侵袭、迁移能力的变化,明确HSP27在COE抑制胃癌EMT中的作用。不同浓度(5,10,20 μg/mL)的COE作用于TNF-α(10 ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24 h后,双荧光素酶的报告基因检测技术检测COE对细胞NF-κB启动子活性的影响。不同浓度(5,10,20μg/mL)的COE作用于SGC-7901细胞12h后或COE(20μg/mL)作用SGC-7901细胞1、3、6、12 h后,Western blot技术检测细胞中NF-κB/Snail信号通路中关键蛋白(NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、Snail)表达的情况,从而明确COE对SGC-7901细胞中NF-κB/Snail信号通路的影响。COE (20 μg/mL)分别作用于TNF-α (10 ng/mL)诱导的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞,通过双荧光素酶的报告基因检测技术及Western blot技术,进一步明确HSP27在COE对TNF-α诱导的NF-κB/Snail信号通路调节中的作用。结果：不同浓度(5,10,20μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10 ng/mL)诱导的SGC-7901细胞24 h后,呈浓度依赖性的抑制HSP27蛋白的表达水平(P0.05),但对HSP27 mRNA表达水平无影响(P0.05)。当加入MG132 (1 μM)后,能够明显减弱COE对HSP27蛋白的抑制作用(P0.01),表明COE所致的HSP27蛋白水平的降低,其机制可能与促进HSP27的泛素化,加快其降解有关。成功构建重组逆转录病毒载体MIGR1-HSP27,转染SGC-7901细胞后,筛选出逆转录病毒细胞株SGC-7901-MIGR1-HSP27和SGC-7901-MIGR1和。Western blot检测结果发现,与SGC-7901细胞相比,SGC-7901-MIGR1细胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表达无变化(P0.05); SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞中E-cadherin蛋白的表达明显下调(P0.01), Vimentin和N-cadherin蛋白的表达明显上调(P0.01)；且SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞的变化效果与TGF-β1 (10 ng/mL)诱导后的结果基本相一致,提示HSP27具有促进SGC-7901细胞EMT发生的作用。COE (20μg/mL)作用于TGF-β1 (10μg/mL)诱导的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞24 h后,能够明显上调上述两种细胞中E-cadherin的表达(P0.01),下调N-cadherin和Vimentin的表达(P0.01),抑制两种细胞的侵袭和迁移能力(P0.01)；且与作用于SGC-7901-MIGR1细胞相比,COE对SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞中EMT相关蛋白表达的调控作用和对细胞侵袭、迁移能力的抑制作用均明显减弱(P0.01),提示HSP27的过表达能够阻止COE对胃癌细胞EMT发生的抑制作用。不同浓度(5、10、 20μg/mL)的COE作用于TNF-α诱导的SGC-7901细胞24 h后,NF-κB荧光素酶活性与TNF-α组相比明显下降(P0.05),表明COE有抑制NF-κB启动子活性的作用。不同浓度(5,10,20μg/mL)的COE作用于SGC-7901细胞12 h后或COE (20μg/mL)作用SGC-7901细胞1、3、6、12 h后,细胞核内的NF-κB p65的表达均明显降低(P0.05)；细胞浆内的NF-κB p65、IκBα的表达均明显增高(P0.05), p-IκBα、Snail的表达量均明显下降(P0.05),且呈浓度和时间依赖性；提示COE可以通过抑制IκBα的磷酸化和降解,避免IκBα的磷酸化带来的NF-κB p65核转位的发生,发挥下调Snail表达的作用。COE (20μg/mL)作用于TNF-α (10 μg/mL)诱导的SGC-7901-MIGR1-HSP27和SGC-7901-MIGR1细胞后,COE能明显抑制上述两种细胞中NF-κB荧光素酶的活性(P0.01),能够明显上调两种细胞中IκBα的表达(P0.01),降低p-IκBα, Snail的表达(P0.01),抑制NF-κB p65核转位的发生；且与作用于SGC-7901-MIGR1细胞相比,COE对SGC-7901-MIGR1-HSP27细胞中NF-κB荧光素酶活性和NF-κB/Snail信号通路的抑制作用均明显减弱(P0.01),提示HSP27的过表达能够阻止COE对NF-κB/Snail信号通路的抑制作用。结论：COE主要通过调控HSP27来抑制胃癌细胞EMT的发生,且HSP27在COE抑制细胞EMT和调控NF-κB/Snail信号通路中起到关键性的调控作用。第三部分南蛇藤提取物抑制胃癌荷瘤裸鼠的生长和转移目的：观察COE对裸鼠胃癌皮下移植瘤生长的影响,以及COE对裸鼠胃癌腹腔转移瘤腹膜种植转移和肝肺转移的影响：并在上述动物模型中探讨HSP27及其下游NF-KB/Snail信号通路是否参与了COE对胃癌EMT的抑制作用。方法：将对数期的胃癌SGC-7901细胞分别注射在裸鼠皮下和腹腔,分别建立裸鼠胃癌的皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型。随机分为正常组、对照组(含1%DMSO的生理盐水溶液),COE低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、局(40mg/kg)剂量组,希罗达(267mg/kg)组,各组裸鼠均灌胃给药。治疗期间每天观察各组裸鼠的精神状态、饮食和活动状态等一般情况。对于皮下移植瘤模型,每隔2d称量裸鼠体重,测算各组裸鼠的肿瘤体积,绘制动态变化的生长曲线；并在治疗结束后,处死各组裸鼠,剥取肿瘤后称量瘤重,计算肿瘤抑制率。对于腹腔转移瘤模型,每隔2d称量裸鼠的体重,观察裸鼠腹部情况,并在治疗结束后,处死各组裸鼠,观察各组裸鼠的腹膜种植转移和肝肺转移的情况。应用免疫组织化学染色检测上述模型的各组裸鼠肿瘤组织中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、 Vimentin)、HSP27、NF-κB p65、Snail的表达水平。结果：成功建立裸鼠胃癌皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型,并使用不同剂量的COE处理各组荷瘤裸鼠。对于皮下移植瘤模型,各组裸鼠的饮食、行为和精神状态在治疗过程中并无明显异常,且COE各剂量组裸鼠体重与对照组相比也无显著性差异(P0.05)。治疗结束后处死裸鼠,发现COE各剂量组能明显抑制移植瘤的体积和瘤重(P0.01),且呈剂量依赖效应。对于腹腔转移瘤模型,COE各剂量组中裸鼠的活动及生长状态在治疗过程中均明显好于对照组。治疗结束后,发现各组裸鼠的大网膜、肠系膜上均有散在的转移结节,但COE各剂量组中转移结节的数目较对照组相比明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。我们重点统计了各组裸鼠腹膜种植转移和肝肺转移的发生率,发现COE各剂量组能够明显抑制腹腔转移瘤的腹膜种植转移和肝肺转移的发生(P0.05),且呈剂量依赖效应。免疫组织化学检测的结果表明：COE可明显上调上述两种模型的移植瘤组织中E-cadherin的表达(P0.05),下调N-cadherin、Vimentin、HSP27、NF-κB p65、Snail蛋白的表达(P0.05),而且呈现剂量依赖性。结论：COE对胃癌荷瘤裸鼠的生长和转移均有明显的抑制作用,其作用机制可能与COE调控HSP27及其下游NF-κB/Snail信号通路而抑制肿瘤EMT的发生有关。
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本文编号：2566877
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