FOXK2激发广泛的转录抑制并且阻遏缺氧反应和乳腺癌发生发展

发布时间：2019-12-01 19:01

【摘要】：Winged helix转录因子FOXK2功能障碍会导致人类的智力障碍、West综合征、Dandy-Walker畸形和并指,然而FOXK2的生物学功能和发挥作用的分子机制尚不清楚。本项研究中首次揭示FOXK2是转录抑制性因子并且鉴定出FOXK2与多种转录抑制复合体(NCoR/SMRT,SIN3A,NuRD和REST/CoREST)在体内均有相互作用。FOXK2同时招募四个不同的复合体抑制体内多种重要癌基因(如EZH2)以及信号传导通路如缺氧反应中的重要因子(如VEGF,HIF1?,HSP90AA1等)的表达。经我们研究结果发现,FOXK2体外可以抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭;体内可以抑制乳腺癌生长和转移。有趣的是,FOXK2可以被雌激素受体转录激活,后被HIF1?/EZH2转录抑制;同时,随着乳腺癌的发生发展,缺氧通路的主要组分HIF1????1?形成二聚体直接作用于EZH2启动子上,转录激活EZH2表达,使乳腺癌侵袭能力增强,恶性度增高。在乳腺癌标本检测FOXK2及相关蛋白的表达水平,实验结果显示FOXK2表达水平与EZH2和HIF1?呈负相关,低表达的FOXK2与乳腺癌中恶性度高的组织学分型、较高临床分级和淋巴结转移阳性等预后不良指标有明确的相关性,充分说明FOXK2的表达下降可作为预后不良的指标。综上所述,本项研究揭示了FOXK2作为一个转录抑制性转录因子,可招募四种抑制性复合体转录调控缺氧通路,文章正式建立了在乳腺癌进程中ER?-FOXK2-HIF1?/EZH2这一分子机制轴线,为乳腺癌介入治疗提供了新靶点和理论依据。
【图文】：

天津医科大学博士学位论文 一、FOXK2 发挥转录抑制作用肾（Renilla）萤光素酶激发底物所释放荧光的数值，每一样品的萤火虫和海肾荧光数值之比即为该质粒转染细胞所得的荧光素酶相对活性。1.2 结果1.2.1FOXK2 发挥转录抑制功能为了探究 FOXK2 作为转录因子在基因转录调控中的作用，我们利用 Gal4 融合蛋白，即报告基因体分析 FOXK2 在转录调控中的作用。我们首先构建了带有Gal4-FOXK2 融合蛋白真核表达载体，将不同剂量的 Gal4-FOXK2 转染入分别稳定表达带有 CMV、AdML、TK 三种启动子的表达报告基因系统的 HeLa 细胞中，用 Gal4 载体调节转染的质粒总量相同（都为 800ng/孔），并同时转染 renilla 质粒检测转染效率，培养 48 小时后，我们收集了稳定表达 Gal4-FOXK2 的 HeLa细胞，，进行双荧光素酶活性检测，并将荧光值与海肾荧光值相比进行校正，共实施了三组生物学重复试验。试验结果显示，随着 Gal4-FOXK2 融合蛋白的增多，荧光值逐渐降低，提示 FOXK2 有明显的转录抑制功能(图 1)。

将去乙酰化酶活性抑制后，FOXK2 的转录抑制作用几乎完全消失(图2)。这说明 FOXK2 调控的转录抑制功能与去乙酰化酶活性相关。图 2：在 HeLa 细胞中转染不同质量的质粒 Gal4-DBD，Gal4-FOXK2，以及相应的表达基因报告系统，并用 TSA 处理。48 小时后收取细胞，进行双荧光素酶活性检测，计算荧光值与海肾荧光值相比值。1.3 讨论Gal4 是酵母（Saccharomyces cerevisiae）转录激活蛋白，是酵母半乳糖的代谢相关基因。Gal4 报告基因主要用于检测蛋白质相互作用的酵母双杂交系统以及在其基础上发展出来的用于检测蛋白质-DNA 相互作用的酵母单杂交系统和酵母三杂交系统。 荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素（Luciferin）氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼等等。细菌荧光素酶对热敏感，目前，以北美荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码 550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个 61kDa 的单体酶，无需表达后修饰，具有酶活性。我们将不同剂量的带有融合蛋白真核表达载体 Gal4-FOXK2 转染进入稳定表达报告基因系统的 HeLa 细胞中
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：2568479