BH3模拟物棉酚和丙戊酸协同诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究
发布时间：2019-12-04 18:03
【摘要】：目的癌症是人类所面临的重大疾病,尽管过去的这些年对癌症的研究做出了很大的努力,并取得了许多重要的成果,但是治愈癌症仍然还是一个临床疾病治疗中的难题;特别是癌症的耐药性,人类癌细胞在化疗过程中产生的药物抵抗是人类癌症治疗过程中所面临的主要障碍。具有不同特性的抗癌药物的联合使用,能克服癌细胞的耐药性,是一种有希望的抗癌治疗策略。棉酚(GOS)是一种天然BH3模拟物,它具有抗细胞增殖和促细胞凋亡的双重活性,是潜在的抗肿瘤药物;但是它在诱导多种癌细胞发生死亡的效应非常有限。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂是一类新型的抗癌药物,通过多种机制抑制肿瘤细胞的增殖,并能诱导肿瘤细胞凋亡;HDAC抑制剂与其它抗癌药物联用能明显地促进后者的抗癌效应。以往的研究显示,HDAC抑制剂丙戊酸(VPA)能够协同性增强GOS对人前列腺癌细胞DU145的细胞毒性。然而,VPA和GOS协同作用的潜在分子机制还不清楚。另外,这种协同作用是否具有普遍性、其它HDAC抑制剂是否也具有同样的协同效应、体内效应如何等一系列问题也未解决。本研究主要以黑素瘤A375、宫颈癌He La和前列腺癌PC-3等人类肿瘤细胞为模型,旨在进一步探索GOS和VPA联合用药协同抑制多种类型人类肿瘤细胞生长的作用机制,并在肿瘤动物模型上进行验证。方法首先在细胞水平上,以WST-1法检测GOS和VPA分别对人类黑素瘤A375、宫颈癌He La和前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。接着利用免疫印迹法检测不同药物处理对细胞凋亡、细胞自噬及信号通路等相关蛋白表达的影响。随后采用免疫荧光显微技术观察GOS和VPA处理后细胞内LC3和LAMP2的共定位,检测自噬体和溶酶体的融合情况。然后利用特异性抑制剂和小分子干扰RNA(si RNA)技术研究相关蛋白和信号通路在GOS+VPA诱导肿瘤细胞凋亡过程中的作用。再以流式细胞术检测GOS和VPA处理对细胞周期分布的影响。并利用实时定量RT-PCR技术(q PCR)分析药物处理对Bim和Fas L等基因m RNA表达水平的影响。最后在动物模型上,通过皮下移植人黑素瘤A375细胞,并用GOS和VPA处理观察联合用药对体内肿瘤生长的影响。结果细胞增殖实验结果表明,无毒性剂量的VPA能明显促进GOS对A375、He La和PC-3的细胞毒性,表现出协同作用。免疫印迹和显微镜观察显示,GOS+VPA能够明显地激活caspase-3,并能诱导PARP剪切和细胞核碎裂,而单独GOS或VPA则没有作用,说明GOS+VPA通过诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡而发挥其协同作用;辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、HDAC6抑制剂tubacin和尼克酰胺(Nico)等其他HDAC抑制剂与GOS联用不能诱导明显的细胞凋亡。细胞自噬似乎不参与GOS+VPA诱导的细胞毒性,因为细胞自噬的抑制对GOS+VPA诱导的细胞死亡没有显著影响。GOS+VPA协同性诱导的肿瘤细胞凋亡似乎与组蛋白的乙酰化水平无关,但是与cyclin A2和Akt信号的下调具有很强的相关性。免疫印迹结果表明,GOS与VPA联合处理明显降低了cyclin A2的表达水平,因而抑制了Akt信号,进而导致FOXO3a去磷酸化而被激活,使得受其调控的靶基因(包括促细胞凋亡的Fas L、Trail和Bim)表达上调;GOS+VPA处理也明显下调了抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表达,激活caspase-8和caspase-9。由此,GOS与VPA联用同时激活了肿瘤细胞的外源性和内源性细胞凋亡通路。si RNA敲低实验结果表明,FOXO3a敲低减弱了Fas L和Bim上调,也减轻了GOS+VPA诱导的细胞凋亡。进一步分析发现,蛋白酶体抑制剂MG132能够明显减弱GOS+VPA处理引起的cyclin A2下调,阻止Akt和FOXO3a的去磷酸化,进而降低了肿瘤细胞的凋亡水平。最后,在裸鼠肿瘤移植模型中,GOS或VPA单独无明显抑瘤作用,而GOS+VPA能显著抑制A375移植肿瘤的生长,表明了GOS和VPA联用在体内也具有协同抗肿瘤效果。结论上述研究结果表明,VPA和GOS能够协同地诱导A375、He La和PC-3等多种肿瘤细胞发生凋亡,没有明显的肿瘤细胞类型特异性;而其他HDAC抑制剂与GOS联用则无明显协同抗肿瘤效应。GOS和VPA联用能有效抑制cyclin-A2/Akt/FOXO3a信号通路,进而激活内源性和外源性细胞凋亡通路,从而协同地诱导肿瘤细胞凋亡。GOS和VPA联合处理导致了cyclin A2的降解,而cyclin A2的降解一定程度上是通过泛素-蛋白酶体途径引起的。此外,GOS和VPA联用在体内也具有协同抗肿瘤效应。总之,这些研究结果说明,GOS和VPA联合使用可能是一种新的潜在的癌症治疗手段,为治疗化疗抵抗性人类癌症提供了一种新的策略。
【图文】：
暨南大学博士学位论文群体中本来就存在耐药的细胞，药物处理后对其进行了筛选，，从而产生耐药另一方面，肿瘤细胞也会随着药物的不断处理而发生进化，从而对药物产生[11]另外，上皮样肿瘤细胞到间质细胞的转化会增强肿瘤细胞的迁移能力和抵抗特性[12]T 细胞在癌症免疫监视和肿瘤杀伤中起着重要的作用，临床通物增强抗肿瘤 T 细胞的反应来治疗癌症已经取得了令人鼓舞的结果 然而，来的研究表明，肿瘤相关基因（如 PTEN BRAF）的突变会导致 T 细胞免疫的抵抗，但当免疫治疗药物和突变基因抑制剂联合处理后会显著改善免疫治效果[13, 14]，提示药物联合使用是克服癌症化疗抵抗的一种有效手段 由于细胞的异质性和常常存在多基因突变的特点，所以几种药物的联合使用往往单药疗效好 因此具有不同作用机制的抗肿瘤药物的联合使用代表了一种强的肿瘤治疗策略
7图 1.2 细胞凋亡和细胞自噬的基本过程[47]Figure 1.2 The processes of apoptosis and autophagy. a The apoptosis pathways: intrinsic andextrinsic apoptosis. Intrinsic apoptosis is marked by one central event - mitochondrial outermembrane permeabilization (MOMP) - which results in the release of cytochrome c from themitochondrial intermembrane space. Cytosolic cytochrome c subsequently triggers the assemblyof the apoptosome. Then directly activate other caspases, such as caspase-3. Extrinsic apoptosisoccurs in response to ligation of the so-called death receptors, including Fas or TNF-relatedapoptosis-inducing ligand receptor (TRAILR). b The core autophagy pathway starts with theformation of an isolation membrane (also called phagophore). A portion of cytoplasm is enclosedby a phagophore or isolation membrane to form an autophagosome. The outer membrane of theautophagosome subsequently fuses with the lysosome, and the internal material is degraded in theautolysosome.
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
本文编号：2569694
【图文】：
暨南大学博士学位论文群体中本来就存在耐药的细胞，药物处理后对其进行了筛选，，从而产生耐药另一方面，肿瘤细胞也会随着药物的不断处理而发生进化，从而对药物产生[11]另外，上皮样肿瘤细胞到间质细胞的转化会增强肿瘤细胞的迁移能力和抵抗特性[12]T 细胞在癌症免疫监视和肿瘤杀伤中起着重要的作用，临床通物增强抗肿瘤 T 细胞的反应来治疗癌症已经取得了令人鼓舞的结果 然而，来的研究表明，肿瘤相关基因（如 PTEN BRAF）的突变会导致 T 细胞免疫的抵抗，但当免疫治疗药物和突变基因抑制剂联合处理后会显著改善免疫治效果[13, 14]，提示药物联合使用是克服癌症化疗抵抗的一种有效手段 由于细胞的异质性和常常存在多基因突变的特点，所以几种药物的联合使用往往单药疗效好 因此具有不同作用机制的抗肿瘤药物的联合使用代表了一种强的肿瘤治疗策略
7图 1.2 细胞凋亡和细胞自噬的基本过程[47]Figure 1.2 The processes of apoptosis and autophagy. a The apoptosis pathways: intrinsic andextrinsic apoptosis. Intrinsic apoptosis is marked by one central event - mitochondrial outermembrane permeabilization (MOMP) - which results in the release of cytochrome c from themitochondrial intermembrane space. Cytosolic cytochrome c subsequently triggers the assemblyof the apoptosome. Then directly activate other caspases, such as caspase-3. Extrinsic apoptosisoccurs in response to ligation of the so-called death receptors, including Fas or TNF-relatedapoptosis-inducing ligand receptor (TRAILR). b The core autophagy pathway starts with theformation of an isolation membrane (also called phagophore). A portion of cytoplasm is enclosedby a phagophore or isolation membrane to form an autophagosome. The outer membrane of theautophagosome subsequently fuses with the lysosome, and the internal material is degraded in theautolysosome.
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
本文编号：2569694
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