IMP3对胃肠胰神经内分泌肿瘤增殖侵袭影响及机制研究

发布时间：2020-01-20 20:48

【摘要】：近十年来,胃肠胰神经内分泌肿瘤(gastroentero-pancreaticneuroendocr ineneoplasm,GEP-NEN)发病呈逐年增加趋势,其临床发病过程隐匿,进展缓慢,约三分之二的患者在疾病确诊时肿瘤已发生转移,但5年生存率超过60%,确定GEP-NEN的肿瘤标志物及浸润转移的早期预警因素极其重要。胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(insuinlike growth factorⅡmRNA binding protein3.IMP3)是胰岛素样生长因子2 mRNA-结合蛋白(IMPs)中的家庭成员之一,IMPs包括IMP1,IMP2以及IMP3。特别是在人类和小鼠胚胎的早期阶段,IMPs可以通过结合目的mRNA进而影响其转运、定位及稳定性。IMP3定位于染色体7p11.5,编码一个长度为4350-bpmRNA表达。人类和小鼠的胚胎发生早期,正常生长的上皮,肌肉及胎盘中均可检测到IMP3,而在成年人正常组织中几乎检测不到IMP3。研究表明IMP3在胃癌,结肠癌和肺腺癌等恶性肿瘤中过表达。并与肿瘤侵袭性的进展相关,这表明IMP3可能在肿瘤浸润和转移中发挥重要作用。以往研究表明癌胚蛋白IMP3是通过激活IGF2,进而IGF2配体激活共同受体-IGF1受体(IGF1R),IGF1R信号转导通路通过介导细胞的有丝分裂,抗凋亡及信号转导。IGF1R作为一种细胞表面受体与酪氨酸激酶结合,进而激活细胞内的第二信使途径如Theras Raf MAPK和PI3K/AKT/mTOR等在内的信号转导通路。近期一项研究表面IMPS基因家族缺失通过下调CD44 mRNA表达进而促进IV型胶原纤维的降解和并与细胞骨架蛋白结合,使细胞与基质间粘附性降低,促进肿瘤细胞的侵袭及转移。IMP3与上述基因关系密切,但关于IMP3对胃肠胰神经内分泌肿瘤的发生、发展的影响目前仍知之甚少。此外,研究表明IMP3与多种肿瘤预后相关:IMP3与胃癌、食管癌、结直肠癌、淋巴瘤等患者术后预后密切相关,并且可以作为独立预后风险因子预测肿瘤患者预后。本研究收集胃肠胰神经内分泌肿瘤的临床及内镜诊治资料,并进行随访,以收集病例中不同增殖能力的神经内分泌肿瘤组织或组织蜡块、神经内分泌癌细胞株为研究对象,应用常规病理、免疫组织化学、免疫细胞化学、蛋白印迹法(westernblot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)以及transwell小室等方法研究imp3在胃肠胰神经内分泌肿瘤组织中的表达及其与胃肠胰神经内分泌肿瘤生物学特性的关系;观察imp3在不同增殖能力神经内分泌瘤及神经内分泌癌细胞株中的表达以及抑制imp3对神经内分泌癌细胞株stc-1细胞增殖、侵袭转移的影响;进而通过抑制imp3表达,阐明imp3在神经内分泌癌增殖、侵袭和转移中的作用,为神经内分泌癌病情的综合评估和分子靶向性治疗提供依据。本研究共分为4个部分:第一部分imp3在不同增殖能力的胃肠胰神经内分泌肿瘤表达及临床预后分析目的:探讨胰岛素样生长因子Ⅱmrna结合蛋白3(insulin-likegrowthfactorⅡmrnabindingprotein3,imp3)在胃肠胰神经内分泌肿瘤(gep-nen)中的表达及意义。方法:选取2006年1月至2014年12月于河北医科大学第四医院资料完整、诊断明确的gep-nen患者162例,其中包括神经内分泌肿瘤g185例,神经内分泌肿瘤g240例,神经内分泌癌g328例及混合腺神经内分泌癌9例,并记录其临床病理特征及随访情况,采用免疫组化法检测imp3、mmp2、igf-1r及cd44的表达,同时对不同增殖分级的肿瘤中imp3及相关指标的表达进行比较。结果:imp3阳性表达率在神经内分泌肿瘤中为74.69%。imp3阳性组与阴性组相比生存时间明显下降,差异有统计学意义(p=0.012);imp3的过表达与肿瘤增殖分级,浸润深度及肿瘤大小相关(均p0.05),imp3阳性表达患者的生存率低于阴性患者(p0.05)。cd44、igf-1r及mmp2在神经内分泌肿瘤中的表达率分别为19.75%,53.7%,55.56%,通过cox生存分析发现imp3过表达、肿瘤大小,肿瘤增殖分级均与gep-nen预后相关。imp3与mmp2及igf-1r表达呈正相关(r=0.288;p0.01andr=0.208;p=0.008),与cd44表达负相关(r=-0.131;p=0.096)。小结:1imp3在神经内分泌癌g3中表达高于神经内分泌肿瘤g1及g2组织,其可能参与了gep-nen的发生进展。2imp3表达阳性gep-nen患者生存率低;imp3可能作为胃肠胰神经内分泌肿瘤的预后因子。3imp3高表达与gep-nen肿瘤浸润及肿瘤大小相关;4imp3与igf-1r及mmp2表达呈正相关,与细胞黏附因子cd44无明显相关性。第二部分imp3与低增殖活性胃肠神经内分泌肿瘤内镜病理特征的关系目的:探讨胰岛素样生长因子Ⅱmrna结合蛋白3(insulin-likegrowthfactorⅡmrnabindingprotein3,imp3)在低增殖活性神经内分泌肿瘤组织中的表达及其与内镜病理特征的关系方法:对内镜诊断及病理证实的神经内分泌肿瘤超声内镜进行病灶评估,选择可切除病例行镜下切除,体外测量病灶大小,结合内镜下表现及临床资料进行分析随访,收集其中18例神经内分泌肿瘤患者内镜切除标本及3例活检标本。所有标本均在手术切除后放入无菌ep管中,并迅速置于液氮中转运至80℃冰箱保存备用。所有患者术前均未接受放、化疗,术后均经病理检查证实免疫组化确诊为神经内分泌肿瘤。采用western-blot法,检测21例神经内分泌肿瘤患者癌组织。结果:1超声胃镜与术后病理对比观察:21例患者均经超声内镜检查明确病变深度,其中18例接受镜下切除治疗,18例患者超声胃镜判断深度与术后病理对照发现准确性88.9%(16/18),超声胃镜对net浸润深度判断具有较高的准确性。2内镜切除疗效及随访:18例切除患者随访12-24个月,无复发转移,对较小的(直径小于1cm)、分化程度较好的g1或g2期胃肠道神经内分泌肿瘤在超声内镜指导下选择合适的内镜切除方法安全有效。3imp3蛋白表达与临床病理特征关系:低增殖活性神经内分泌肿瘤组织内imp3蛋白表达采用westem-blot法,检测21例低增殖活性神经内分泌肿瘤患者组织内imp3蛋白表达阳性。结果显示,低增殖活性神经内分泌肿瘤组织内imp3蛋白表达量在增殖分级、肿瘤大小及浸润深度分组中表达有统计学意义(1.4176±0.1168vs0.8187±0.3169,p0.001;1.3806±0.1286vs0.8372±0.3491,p0.05;1.3801±0.1268vs0.7470±0.2814,p0.05),而在年龄、性别、肿瘤个数及肿瘤发生部位等分组中无明显差异。小结:1小于等于1cm的低增殖活性神经内分泌肿瘤内镜微创治疗安全有效;2imp3蛋白在低增殖活性神经内分泌肿瘤中g2期imp3表达阳性率明显高于g1期患者;3低增殖活性神经内分泌肿瘤组织内imp3蛋白表达量与肿瘤大小及浸润深度相关。第三部分 imp3对小肠神经内分泌肿瘤细胞增殖侵袭迁移生物学特性的影响目的:探讨sirna抑制胰岛素样生长因子Ⅱmrna结合蛋白3(imp3))基因表达对小鼠神经内分泌癌stc-1细胞增殖侵袭迁移活性的影响。方法:构建针对imp3的sirna序列3条,非特异性sirna序列1条,筛选鉴定效果最佳的imp3-sirna;应用imp3-sirna转染小鼠神经内分泌癌细胞株stc-1;免疫细胞化学染色观察细胞中蛋白表达情况;mtt法检测细胞生长曲线;brdu法检测细胞dna合成能力,通过transwell小室模型分析imp3对stc-1细胞迁移和侵袭的影响。结果:成功构建imp3-sirna转染体系,imp3-sirna-1转染stc-1细胞,免疫细胞化学染色结果显示,与con组及ns-sirna组相比,imp3-sirna组细胞株imp3的染色较浅,mtt实验及brdu法掺入实验发现,与con组及ns-sirna组相比,imp3-sirna组dna合成能力减弱,细胞增殖能力明显降低;transwell小室模型分析发现与con组及ns-sirna组相比,imp3-sirna组的细胞迁移及跨膜侵袭能力均受到明显抑制(p0.05)。小结:1成功构建imp3-sirna序列3条,其中imp3-sirna-1转染效率最高,抑制imp3效果最好;2抑制imp3表达后stc-1细胞增殖活性降低;3抑制imp3表达后stc-1细胞跨膜迁移活性及细胞迁移率均受到明显抑制;第四部分 imp3对小肠神经内分泌肿瘤细胞增殖侵袭迁移影响的作用机制目的:探讨sirna抑制胰岛素样生长因子Ⅱmrna结合蛋白3(imp3))基因表达对小鼠神经内分泌癌stc-1细胞增殖侵袭迁移活性影响的作用机制。方法:选取第三部分中沉默效果最佳的一条imp3-sirna-1;应用imp3-sirna转染小鼠神经内分泌癌细胞株stc-1;westernblot检测干扰imp3蛋白表达后并检测ns-sirna组肿瘤凋亡增殖生长(p27,cyclindl,egfr和ki67)、侵袭转移(igf1r,vegfa,mmp9,mmp2)等相关指标的变化结果:imp3-sirna-1转染stc-1细胞,与con组及ns-sirna组相比,imp3-sirna组肿瘤凋亡增殖蛋白,egfr和ki67蛋白表达水平明显下调,而cyclindl、p27蛋白表达未见明显变化;与con组及ns-sirna组相比,imp3-sirna组侵袭转移相关蛋白igf1r,vegfa,mmp2,mmp9蛋白表达减低。小结:1imp3沉默可能通过下调与肿瘤增殖生长相关的蛋白egfr和ki67的表达来抑制神经内分泌癌细胞的增殖。2imp3沉默可能通过igf1r信号转导通路下调vegfa、基质金属蛋白酶mmp2、mmp9等相关蛋白,进而影响神经内分泌肿瘤细胞的侵袭迁移,促进肿瘤的发展。结论:1imp3表达与胃肠胰神经内分泌肿瘤的生物学特性相关;其在gep-nen组织中阳性表达率较高;在神经内分泌癌g3及manec组织中表达高于神经内分泌肿瘤g1、g2组织;其可能参与了gep-nen的发生进展。imp3表达阳性gep-nen患者生存率低,imp3可能作为胃肠胰神经内分泌肿瘤的预后因子。2超声内镜评估胃肠低增殖活性神经内分泌肿瘤准确性高,并可以指导内镜切除方式;小于等于1cm的胃肠低增殖活性神经内分泌肿瘤内镜微创治疗安全有效。在低增殖活性的胃肠低增殖活性神经内分泌肿瘤中imp3表达存在差异,肿瘤大小及浸润深度不同imp3表达同样存在差异,IMP3蛋白可能成为低增殖活性胃肠神经内分泌肿瘤的内镜诊疗效果及预后评价的指标。3成功构建IMP3-siRNA序列3条,其IMP3-siRNA-1转染效率最高,抑制IMP3效果最好;抑制IMP3表达后STC-1细胞活性降低、细胞增殖受到抑制;细胞迁移活性降低;细胞跨膜侵袭率均受到明显抑制4抑制IMP3表达后;可能通过下调与肿瘤增殖生长相关的蛋白EGFR和ki67的表达来抑制神经内分泌癌细胞细胞的增殖。调节其下游的IGF1R信号转导通路下调VEGFA的表达,减少基质金属蛋白酶MMP2、MMP9分泌,进而影响神经内分泌肿瘤细胞的侵袭迁移,促进肿瘤的发展。5 IMP3可能是胃肠胰神经内分泌肿瘤的一个重要分子靶点,通过抑制IMP3表达可能发挥抗胃肠胰神经内分泌肿瘤的作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9

【参考文献】