CHKA表达对肺腺癌不良预后预测作用及相关机制的研究

发布时间：2020-01-21 05:23

【摘要】：研究背景和目的近年来肺癌已成为最常见的恶性肿瘤,人们对肺癌的认识已经有了一定的发展进步,但肺癌相关的死亡率在全世界范围内呈明显上升趋势；由于吸烟和环境因素的影响,肺腺癌已成为肺癌最重要的病理类型,且成为男性恶性肿瘤的首要死亡原因,肺腺癌的发生发展涉及多个基因,大多数肺腺癌患者并非死于肿瘤原发灶本身,而是死于肿瘤的复发以及转移。进一步研究肺腺癌的发生发展与转移的分子机制,探析其预后相关的影响因子,明确潜在的靶点,具有十分重要的临床意义。目前肺癌的发生机制尚不清楚,因此对其治疗亦缺乏特异性。胆碱激酶是生物体细胞内催化胆碱为磷酸胆碱,最终合成生物膜磷脂双分子层的主要成分磷脂酰胆碱过程中的第一步关键酶。该酶由胆碱激酶a (Choline kinase a,CHKA)和胆碱激酶β (CHKB)两个基因编码,二者通过同二聚体或异二聚体的方式形成有活性的胆碱激酶。以往相关学者研究主要关注该酶在脂类代谢中的功能,其中CHKA是将胆碱转化为磷脂酸胆碱的酶,在人类肿瘤中的作用已经被广泛研究。CHKA作为一种发挥重要作用的酶,在主要生长因子激活的生长信号通路如Ras信号通路激活以及在一些人类肿瘤细胞和组织中起着重要的激活作用；另外大量关于肿瘤细胞的研究结果提示：CHKA在癌基因介导转换以及包括肺癌在内的人类肿瘤形成的过程中,扮演着重要的角色。近年来,很多研究显示CHKA及其催化产物磷酸胆碱在多种肿瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等中呈高表达,并且发现CHKA的表达水平与乳腺癌、肺癌和膀胱癌患者的临床预后存在相关性,被认为参与了这些肿瘤的发生发展;基于CHKA在肿瘤发生发展中的作用,目前许多研究聚焦于CHKA抑制剂方面的研究,认为其可以促进肿瘤细胞的凋亡,发挥抗肿瘤作用；一些研究小组还通过各种体内外实验证实CHKA具有癌基因的功能,这些结果均提示CHKA可能在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。然而,CHKA在肺腺癌中的表达情况如何,是否与肺腺癌患者的临床预后相关、是否参与肺腺癌的恶性进展过程,目前国内外尚未见有系统研究。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition, EMT)最早在1982年提出,是指在特定的生理和病理情况下上皮细胞通过一系列改变向间充质细胞分化的现象,具体表现为：上皮细胞丧失极性并获得间质表型、细胞间的连接及黏附能力下降或消失、细胞迁移和转移侵袭能力增加、细胞形态改变、以及细胞标志物表达水平的变化,如连环素(β-catenin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞标志物表达下调,波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)等间质表型标志物表达增加等。EMT在胚胎发育、组织发生中发挥着重要作用,并存在于多种慢性疾病的发病过程和肿瘤的浸润转移过程中。调控细胞EMT发生的分子机制比较复杂,而且涉及多条细胞信号转导通路。目前已报道的细胞信号转导通路主要有TGF-β通路、PI3-K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Src通路以及整合素通路等。根据目前研究观点认为,EMT对于各种癌症具有积极的预后预测作用,其与侵入性表型和转移行为能力呈高度相关。大量研究表明“EMT表型”是决定肺癌预后的主要因素,在非小细胞肺癌,EMT表型与表皮生长因子受体突变和耐药性的研究中上述观点已被证实。而进一步的研究发现,对比其他实体肿瘤,对肺癌患者不良预后具有预测作用的循环肿瘤细胞(CTC)表达上皮标记EpCAM较低,这表明肺癌细胞在转移的前期已经经历了EMT,循环肿瘤细胞失去上皮细胞特征；而文献报道,CTC中EMT分子分型和数量是影响肺癌微转移的重要指征,对肺癌患者的预后和治疗具有重要的指导意义。尽管越来越多的证据表明EMT实际是存在于肿瘤转移的动态的过程中,但是诱发EMT并调控相关通路的关键基因及其作用机制尚不明确,有待于进一步研究加以阐明。近年来,不少研究结果显示胆碱激酶及其催化产物磷酸胆碱在包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌以及卵巢癌在内的多种肿瘤中呈高表达,而且发现CHKA的表达水平与乳腺癌、肝癌和膀胱癌患者的临床预后存在相关性；实验证实CHKA具有癌基因特性,并参与到恶性肿瘤发生发展之中,影响疾病预后。然而CHKA在肺癌中表达情况如何、是否参与肺癌的恶性进展过程,以及CHKA的表达与肺腺癌临床病理特性之间的关系尚不清楚。作为一种重要的原癌基因,CHKA在肺腺癌发生和发展中的作用以及与肺腺癌的预后关系尚无报道,且CHKA是否影响肺上皮细胞的上皮间质转化也从未被探讨。本研究主要聚焦于CHKA在肺腺癌中的表达及其临床转化意义,并进一步探讨其介导肺癌不良预后的生物学作用和相关分子机制。第一部分CHKA表达对肺腺癌预后预测作用的临床研究研究背景和目的肺癌已成为全球最常见的恶性肿瘤,严重威胁人类的生命健康,其发病率和死亡率居高不下,这与肺癌的发病机制不清、缺乏有效的早期诊断和预防手段有关。大多数肺癌患者并非死于肿瘤原发灶,而是死于肿瘤的复发以及转移。因此,深入研究肺癌发生发展与转移的分子机制,探讨其预后相关的影响因子,明确潜在的靶点,对肺癌的防治具有重要的临床意义。Choline kinase a (CHKA)是一种将胆碱转化为磷脂酸胆碱的酶,近年来其在人类肿瘤中的作用引起了研究者的关注,CHKA在癌基因介导转换以及在肺癌等多种人类肿瘤形成的过程中均扮演了重要的角色。截止目前研究,CHKA在肺腺癌中的表达及其与临床病理特征之间的关系尚不清楚。本研究旨在通过检测CHKA在肺癌组织样本中的表达情况,分析其与肺腺癌患者临床病理特征之间的关系,探讨CHKA表达与患者生存时间的相关性,及其在肺腺癌发生发展及转移中的作用,为进一步探索其中的分子机制打下扎实的理论和实验基础。研究方法1.分别应用免疫组织化学、RT-PCR、Western Blot方法检测肺腺癌组织及相应癌旁组织样品中CHKA的表达情况；2.运用统计学方法分析CHKA的表达与患者的临床病理特征、预后资料和生存期的相关性。研究结果1.肺腺癌组织中CHKA基因拷贝数、mRNA的表达均明显高于癌旁组织；2.肺腺癌组织中CHKA蛋白呈普遍高表达,明显高于癌旁组织；3.肺腺癌组织中CHKA的高表达与肿瘤微血管侵犯、分期和分化状态及低生存时间有关。结论1.肺腺癌组织中CHKA表达增加；2.CHKA的高表达与肺腺癌患者不良预后密切相关；3. CHKA表达增加与患者的一些临床病理特性,如肿瘤直径、分期和分化状态具有相关性；4.高表达CHKA的患者总体生存时间短,且肿瘤复发较早；5.CHKA有望成为肺腺癌患者预后预测作用的分子标记物。第二部分CHKA表达对肺腺癌预后预测作用的机制研究研究背景和目的寻找早期诊断和预后判断指标是肺腺癌基础和临床研究中亟待解决的重大问题,也是防治肺腺癌必须针对性研究的主要环节。进一步深入探讨在肺腺癌发生发展与转移过程中起重要作用基因的分子机制,对肺腺癌早期诊治的转化研究具有重要的意义。研究显示,Choline kinase α (CHKA)可以诱导人体内正常细胞转换形成肿瘤细胞,CHKA特异性抑制剂已被证明具有体外抗增殖和体内抗肿瘤活性作用。我们前期研究发现,CHKA有望成为肺腺癌患者预后预测作用的分子标记物,但其作用的分子机制尚不明确。上皮-间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)是一个细胞表型转化的过程,在此过程中细胞由极性上皮细胞表型转化为间质表型,细胞粘附力降低,迁移和侵袭能力增加。本研究旨在体外水平上,观察CHKA在肺腺癌细胞发生EMT中的作用及其对肺腺癌细胞迁移与侵袭中的作用,并进一步探究CHKA表达对肺腺癌预后预测作用的分子机制。研究方法1.应用RT-PCR、Western Blot检测肺腺癌细胞中CHKA的表达情况；2.利用慢病毒感染的方法建立干扰CHKA的肺腺癌细胞系及其对照细胞系；3.对短发夹CHKA (short hairpin CHKA, shCHKA)及其对照细胞系分别采用增殖实验、穿膜实验和侵袭实验等方法观察干扰CHKA表达后对肺腺癌细胞系侵袭和转移能力等生物学行为的影响。研究结果1.过表达CHKA能促进肺腺癌细胞的迁移与侵袭能力；2.过表达CHKA可使肺腺癌细胞发生EMT转化；3.干扰CHKA则能有效抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭能力；4.过表达CHKA激活PI3K/Akt信号通路,干扰CHKA则明显抑制PI3K/Akt通路；5.抑制PI3K/Akt通路可明显减轻CHKA介导的促迁移与侵袭能力。结论1.过表达CHKA可使肺腺癌细胞发生EMT转化,促进肺腺癌细胞发生迁移与侵袭；2. CHKA促进肺腺癌细胞迁移与侵袭的效应可能主要是通过PI3K/Akt信号通路所介导的；3.本研究揭示了一种新的肺腺癌分子标记物,CHKA有望成为肺腺癌患者预后预测的分子标记物和治疗靶点。
【图文】：

免疫组化检测,腺癌,肿瘤,分析验证

中明思比相应的癌旁组织高。而对患者组织芯片行uQＫＡ免疫组化实验同样得到一逡逑致性的结论。逡逑本研究结果发现，，肺腺癌姐织中}0ＫＡ表达较癌旁组织显著增加（图１Ａ和逡逑１Ｂ），实时ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ分析验证／这个结果（图１Ｃ和１Ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕ邋巧邋１逡逑R誛祀…… 逡逑Ｂ逦Ｄ逡逑ｓ，．邋Ｉ邋＊邋ｉ邋Ｉ邋下邋Ｉ逦ｃｗＡ邋■诵W 逡逑ｓ邋Ｉ逦Ｉ逦厂逦—逦＇逦—＇逡逑ｗ邋甲—逦ｗ…Ｈ逡逑Ｕ逦Ｔｕｍｏｒ邋ＰｖｒＭｕｍｅｒ邋Ｔｉｔｍｅｒ邋Ｐｗｔ－ｔｔｉｍｅｒ邋ｌＵｍｏｒ邋ＰｖｆＭｕｍｏ＊逡逑Ｔｕｍｏｒ逡逑图１免疫组化检测肿瘤}D织巧片ＣＨＫＡ的表达逡逑图１Ａ．和固；ＬＢ．免疫姐织化学染色１１９例组织芯片ＣＨＫＡ的表达，进而分析帅腺癌巧巧癌ｍ织靴逡逑２３逡逑

中位数,肺腺癌,临床意义,腺癌

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【参考文献】