组蛋白去乙酰化酶2对人肺腺癌A549细胞的作用和调节

发布时间：2020-01-22 11:47

【摘要】：肺癌是全球发病率居于首位的恶性肿瘤,全球每年新发肺癌120万例,我国每年有60万人死于肺癌。在我国城市因肿瘤而死亡的人口中,肺癌列居首位。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)是维持染色体的基本组成单位核小体中组蛋白乙酰化平衡的关键酶类之一,其作用为催化组蛋白的去乙酰化,与基因的转录与抑制有密切的关系,涉及基因沉默的复杂过程,是抗肿瘤药物设计作用的热门靶点。组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)家族的成员之一,在胚胎及哺乳动物细胞中广泛表达,几乎参与所有细胞功能,包括细胞增殖、凋亡、分化等。目前发现许多肿瘤都存在HDAC2高表达,并且在不同肿瘤中的作用机制不一致,在肺癌中的作用目前尚未有明确统一的报道。本课题从细胞和组织水平上探讨HDAC2在人肺腺癌中的作用,利用细胞和分子生物学技术,通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默人肺腺癌A549细胞中HDAC2的表达,研究HDAC2基因在体外环境中对人肺腺癌A549细胞生物学行为的影响及其机制；收集人肺腺癌及其癌旁组织,采用RT-PCR法、Western blot及免疫荧光法检测人肺腺癌及其癌旁组织中HDAC2的表达,探讨HDAC2与临床病理的关系。研究内容包括以下三部分：第一部分组蛋白去乙酰化酶2在肺腺癌组织中的表达目的：检测肺腺癌组织和相应癌旁组织中HDAC2mRNA和HDAC2的表达情况。方法：收集经广西医科大学第一附属医院病理科确诊的人肺腺癌患者手术标本30例,相应癌旁组织作为对照,运用Western blot法及免疫荧光法检测肺腺癌组织及癌旁组织中HDAC2的表达水平,RT-PCR检测HDAC2mRNA表达水平。结果：1、RT-PCR结果示30例肺腺癌组织及癌旁组织结果显示,肺癌组织HDAC2mRNA相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。2、Western blot检测肺腺癌及癌旁组织HDAC2表达灰度值结果显示,肺腺癌组与对照组比较,其HDAC2表达量下调,差异具有统计学意义(P0.05)。3、免疫荧光结果示HDAC2在人肺腺癌组织切片和对照组细胞浆和细胞核均有表达,表现为绿色荧光。人肺腺癌组织切片免疫荧光染色结果显示,人肺腺癌组织的荧光强度较癌旁组织弱,差异具有统计学意义，(P0.05)。结论：HDAC2在人肺腺癌组织中表达较癌旁组织低,提示HDAC2与肺腺癌相关。第二部分红霉素对A549细胞HDAC2的影响目的：肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,本文探讨红霉素(EM)对烟草烟雾提取物(CSE)刺激肺腺癌A549细胞的组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的作用。研究EM对顺铂(CDDP)诱导A549细胞凋亡作用的影响,及其对A549细胞周期的影响。方法：以A549细胞为研究对象,予CSE以及EM、CDDP作用。(1)药物浓度以及作用时间的确定：CSE浓度为0.5%、1%、2.5%、5%,EM浓度为10、20、40、80μg/ml。实验分组：①空白对照组(只加10%灭活胎牛血清FBS的RPMI-1640细胞培养液)；②0.5%CSE组；③0.5%CSE+10μg/ml EM组。分别用不同浓度CSE和不同浓度EM处理A549细胞,然后用光学倒置显微镜观察A549细胞的生长形态；用CCK-8法检测不同浓度CSE、EM在不同时间对A549细胞活性的影响；用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测不同浓度CSE或不同浓度EM处理A549细胞后,细胞培养液中IL-6、IL-8、TNF-α浓度；用蛋白质印迹法(Western blot, WB)检测各组A549细胞HDAC2的表达;RT-PCR分别检测各组细胞HDAC2mRNA、IL-6mRNA、IL-8mRNA. TNF-amRNA的表达。(2)以A549细胞为研究对象,配制CDDP浓度为0.25mg/L、0.5mg/L. 1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L。不同浓度CDDP刺激A549细胞48h,用CCK-8法检测不同浓度CDDP处理A549细胞后的细胞活性,并分别计算CDDP各自的半数抑制浓度(50% inhibiting concentration, IC50)。将实验分组为,①空白对照组(只加10%灭活FBS的RPMI-1640细胞培养液)；②EM组；③IC50-CDDP+10μg/ml EM。各组细胞培养48h后,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡、细胞周期百分比。结果：(1)CCK-8法检测各组A549细胞活性。与空白对照组比较,0.5%CSE处理细胞24、48小时和1%CSE处理细胞24小时,10μg/ml EM处理细胞24、48小时,细胞活性未见明显抑制,差异不具统计学意义(p0.05)。而其他各CSE、EM组细胞活性均受到不同程度抑制,差异均具有统计学意义(p0.05),并且在一定范围内呈剂量和时间依赖性,药物剂量越大,培养时间越长,细胞生长受抑制程度也越严重。(2) ELISA法检测各组A549细胞的IL-6、IL-8和TNF-a含量。与空白对照组比较,0.5%CSE处理A549细胞24、48小时,1%CSE处理细胞24小时,细胞分泌IL-6、IL-8和TNF-a均增高,差异均有统计学意义(p0.05)。其他各CSE组细胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-a均下降,而且随着CSE浓度增高或者培养时间延长,炎症因子分泌下降越严重,差异均有统计学意义(p0.05)。与空白对照组比较,在不同时间用不同浓度EM处理A549细胞,炎症因子分泌均受到抑制,并且呈剂量和时间依赖性,EM剂量越大,培养时间越长,炎症因子分泌受抑制程度越严重,差异均有统计学意义(p0.05)。(3)与空白对照组比较,0.5%CSE处理后的A549细胞HDAC2mRNA表达量下降,差异有统计学意义(P0.05)。而与0.5%CSE组对比,10μg/mlEM可以上调烟草烟雾暴露的A549细胞HDAC2mRNA表达量,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)与空白对照组比较,0.5%CSE处理A549细胞后,IL-6mRNA、 IL-8mRNA和TNF-amRNA表达均增高,差异均具有统计学意义(P0.05)；与0.5%CSE组对比,10μg/ml EM可以降低烟草烟雾暴露的A549细胞IL-8mRNA和TNF-amRNA的表达,差异均具有统计学意义(P0.05)。(5)CCK-8结果提示,不同浓度CDDP处理A549细胞48h,细胞生长受到不同程度抑制,并且呈浓度抑制依赖性,浓度越高,对细胞生长抑制作用越大,与空白对照组相比,差异均具有统计学意义(p0.05)。IC50-CDDP为3.449 mg/L。(6) IC50-CDDP作用于EM预处理的A549细胞48h后,与空白对照组比较,早期细胞凋亡增多,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞周期结果显示细胞周期G0/G1期比例增加,差异具有统计学意义(p0.05)。(7)与空白对照组比较,10μg/ml EM刺激A549细胞后,细胞周期G0/G1期比例增加,差异具有统计学意义(p0.05)。但细胞凋亡无明显增加(p0.05)。结论：1.0.5%CSE可使A549细胞产生炎症反应,而EM可抑制烟草烟雾暴露的A549细胞的炎症反应,其作用机制可能是通过上调烟草烟雾暴露的A549细胞HDAC2活性而产生作用。2.EM可增强CDDP对A549细胞的细胞阻滞作用,其机制可能与EM调节的HDAC2表达增加引起的CyclinD1的活性下降有关。3.EM可增强CDDP对A549细胞的凋亡作用,其机制可能与EM可提高A549细胞的HDAC2表达,从而促进凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-3表达增加密切相关。因此EM联合CDDP可考虑作为治疗肺腺癌合并有肺部炎症性疾病患者的新型药物组合。结论：1.0.5%CSE可使A549细胞产生炎症反应,而EM可抑制烟草烟雾暴露的A549细胞的炎症反应,其作用机制可能是通过上调烟草烟雾暴露的A549细胞HDAC2活性而产生作用。2.EM可增强CDDP对A549细胞的细胞阻滞作用,其机制可能与EM调节的HDAC2表达增加引起的CyclinD1的活性下降有关。3.EM可增强CDDP对A549细胞的凋亡作用,其机制可能与EM可提高A549细胞的HDAC2表达,从而促进凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-3表达增加密切相关。因此EM联合CDDP可考虑作为治疗肺腺癌合并有肺部炎症性疾病患者的新型药物组合。第三部分RNAi沉默A549细胞HDAC2基因对红霉素作用的影响目的：采用LV-HDAC2-RNAi慢病毒载体转染人肺腺癌A549细胞,观察沉默HDAC2基因在体外对人肺腺癌A549细胞生物学行为的影响,并探讨EM对其作用机制。方法：使用LV-HDAC2-RNAi慢病毒载体及空载质粒病毒载体转染人肺腺癌A549细胞,并建立稳定转染细胞株分别命名为实验组(RNAi-A549)和阴性对照组(NC-A549)。通过荧光定量PCR、Western blot、ELISA等方法检测EM对实验组(RNAi-A549)、阴性对照组(NC-A549)和空白组(A549)中HDAC2、caspase-9、caspase-3以及CyclinDl的表达情况,以验证EM通过调节HDAC2的表达对A549细胞的抗炎、促进凋亡等效果。结果：1、荧光定量PCR, Western blot及免疫荧光染色结果均显示,实验组细胞HDAC2 mRNA和HDAC2蛋白的表达明显低于两组对照组(P0.05);2、EM对RNAi-A549细胞功能明显受到抑制,caspase-3 mRNA以及caspase-9 mRNA表达在RNAi-A549组中明显下降,cyclinD1mRNA在RNAi-A549组表达升高。结论：1、成功构建并筛选出稳定沉默HDAC2基因的实验组(RNAi-A549)和空载体阴性对照组(NC-A549)细胞株。2、HDAC2基因沉默后EM的作用效果下降,其机制与A549细胞HDAC2序列受沉默有关,EM对A549的效果下降。EM的抗炎、促进A549细胞凋亡为通过上调HDAC2活性实现。
【图文】：

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组蛋白去乙憸化酶２对人肺腺癌Ａ５４９细胞的作用和调节逦博士学位论文逡逑表１－１邋ＨＤＡＣ２ｍＲＮＡ在各组标本中的相对表达量（Ｘ士ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＨＤＡＣ２ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋Ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋（邋ｘ±ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ逦Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ａｍｏｕｎｔ逡逑ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逦０．３４０８士（）？邋１２６９＇逡逑ｐａｒａｔｕｍｏｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逦０．４１３５士０．１４８６逡逑＊注：与对照组比较，差异具有统计学意义（八０．０５）。逡逑

荧光图像,细胞,对照组,二醛

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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】