【摘要】：白血病细胞的迁移是其发生浸润的关键步骤,基质细胞衍生因子-1(SDF-1)能通过引发相应的信号通路引起细胞迁移,细胞迁移过程与细胞骨架的变化密切相关,而RhoGTP酶主要调控肌动蛋白细胞骨架,因此本论文研究RhoGTP酶家族的主要成员Rho在SDF-1引起的白血病细胞迁移过程中的作用。本论文首先用不同浓度的SDF-1(0、25、50、100和200 ng/ml)刺激Jurkat细胞,Transwell实验观察细胞迁移情况;接着用细胞骨架的抑制剂处理Jurkat细胞,验证细胞迁移与细胞骨架的关系;随后激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SDF-1刺激Jurkat细胞后细胞骨架的变化情况。在此基础上,研究细胞内重要信号效应分子ROS和NO在SDF-1引起的Jurkat细胞迁移过程中的作用。首先SDF-1刺激Jurkat细胞后,流式细胞术检测ROS的产生情况,酶标仪检测NO的产生情况;接着探究ROS和NO是否参与SDF-1诱导的Jurkat细胞骨架的变化和细胞迁移;随后用Rho的抑制剂处理Jurkat细胞,检测SDF-1刺激后ROS和NO的产生与Rho的关系;然后研究Rho是否参与SDF-1引起的Jurkat细胞骨架变化和细胞迁移;Western Blot实验进一步检测SDF-1刺激Jurkat细胞后,RhoA、RhoB和RhoC的活化情况;最后siRNA转染干涉RhoA和RhoC的表达,Transwell实验研究RhoA和RhoC是否都参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移。另外,为了进一步研究RhoA和RhoC在SDF-1引起的Jurkat细胞迁移过程中的作用,将它们的抑制因子RhoGDI2进行干涉,荧光显微镜观察Jurkat细胞的侵染效率、Western Blot鉴定RhoGDI2 shRNA在Jurkat细胞内的表达情况。实验结果如下:1.SDF-1通过改变细胞骨架的重排和聚合参与Jurkat细胞迁移SDF-1引起的Jurkat细胞迁移具有浓度依赖效应,随着浓度的增大,迁移现象越明显;细胞松弛素B预处理Jurkat细胞,SDF-1刺激4 h,细胞迁移现象极显著地受到抑制;SDF-1刺激4 h,Jurkat细胞骨架发生重排和聚合。2.ROS和NO通过改变细胞骨架的重排和聚合参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移SDF-1刺激Jurkat细胞0、1、2、3和4 h,细胞内ROS和NO的表达水平在4 h时极显著地高于对照组;NAC和L-NMMA预处理Jurkat细胞,SDF-1刺激4 h,细胞骨架的重排和聚合现象以及细胞迁移现象都极显著地受到抑制。3.RhoA和RhoC通过改变细胞骨架的重排和聚合参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移CT04预处理Jurkat细胞,SDF-1刺激细胞4 h,极显著地抑制了ROS和NO的表达、细胞骨架的重排和聚合以及细胞迁移;Jurkat细胞内只表达RhoA和RhoC,不表达RhoB;SDF-1刺激4 h,RhoA和RhoC都发生活化;RhoA和RhoC都参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移;构建质粒RhoGDI2 shRNA,包装病毒并侵染Jurkat细胞,RhoGDI2sh1和sh2均能显著降低Jurkat细胞内RhoGDI2的表达量。由以上研究结果得出如下结论:1.SDF-1可以引起Jurkat细胞发生迁移、细胞骨架发生重排和聚合,并且通过改变细胞骨架的重排和聚合参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移。2.SDF-1可以引起Jurkat细胞内ROS和NO的产生,ROS和NO通过改变细胞骨架的重排和聚合参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移。3.SDF-1引起Jurkat细胞内ROS和NO的产生依赖于Rho的活化,SDF-1刺激后可使Jurkat细胞内RhoA和Rho C活化,并且RhoA和RhoC通过改变细胞骨架的重排和聚合参与SDF-1引起的Jurkat细胞迁移。构建的RhoGDI2 shRNA慢病毒表达质粒成功侵染Jurkat细胞并抑制了RhoA和RhoC调控因子RhoGDI2的表达。本论文着重研究Rho在SDF-1引起的Jurkat细胞迁移中的作用,阐明了此过程中的相关信号通路,为研究SDF-1引起的急性淋巴细胞白血病细胞迁移机制提供了可靠的理论依据,为治疗白血病提供了新的作用靶点。
【图文】：
最终用 PBS 重悬后，，流式细胞仪检测的荧光值，将结果表示为相对荧光指数（RFI）。采用 SPSS 17.0 软件分析，各处理组与对照组的比较OVA），结果用平均值±标准差（Mean ± SD）表示流式细胞仪检测的结果采用 Flowjo 软件分析。起 Jurkat 细胞迁移 实验观察统计细胞的相对迁移倍数，结果如图 2.1 0 和 200 ng/ml 均可以极显著地引起 Jurkat 细胞迁移、19.7、33.3 和 51.2，并且 Jurkat 细胞相对迁移倍数DF-1 浓度越大，细胞迁移能力越强。
connection between SDF-1-induced cytoskeletal changes and migra(n=3) （**p<0.01） 引起 Jurkat 细胞骨架重排聚焦显微镜观察细胞骨架的变化情况如图 2.3 所示：FISDF-1（25 ng/ml）刺激细胞 4 h，对照组中细胞骨架呈现细胞骨架发生了重排现象。结果表明 SDF-1 刺激后，Jur
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.7
【参考文献】
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本文编号：
2572003
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