SIRT5在肝细胞肝癌发生发展中的作用研究

发布时间：2020-02-12 21:19

【摘要】：研究背景及目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(以下简称肝癌或HCC)是常见的消化道恶性肿瘤。国际癌症研究机构公布的GLOBOCAN 2008资料显示,在全球范围内HCC的发病率在男性位列第5位,在女性位列第7位;在癌症相关死亡中位列第3位。我国是肝癌大国,肝癌病例数占世界的一半以上,肝癌的发病率和死亡率在肿瘤中均位居前列。近年来,以手术为主的综合治疗取得了一定效果,但术后肝癌患者仍高的复发转移率成为改善肝癌患者预后的主要障碍。即使是小肝癌(5cm)行根治切除或肝脏移植后3年复发率也高达50%以上。快速增殖和侵袭转移是肝癌重要的生物学特征,也是导致肝癌患者预后较差、5年生存率低的重要因素之一。因此,研究导致肝癌增殖、转移的原因,揭示其相关机制对提高HCC患者预后有重要意义。沉默信息调节因子(Silent information regulator,Sirtuin)(Sirt)是一类由多个组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)成员组成的蛋白家族。研究证实SIRT家族成员通过对组蛋白及多种非组蛋白进行去乙酰化修饰来调节基因的表达,参与细胞分化、凋亡、衰老、能量代谢及应激耐受等多种重要的生理活动,从而可能在肿瘤的形成和发展过程中发挥着重要的作用。对于SIRT家族在恶性肿瘤中生物学功能及其相关机制的探索有助于我们更全面的了解HCC的发生发展机理,寻找新的诊治标志物和相关靶点。SIRT5是沉默信息调节因子家族中的一员,近期研究报道其在乳腺癌和肺癌中可能发挥癌基因的作用,但其在早期肿瘤中的具体生物学功能,尤其是在肝癌中的作用尚无相关研究报道。本研究拟在高通量芯片筛选预后较差的HCC病例特异性差异表达的mRNA基础上,利用qRT-PCR和免疫组化技术检测SIRT5在HCC中的表达,明确其临床意义,进而进一步利用体内外功能实验明确SIRT5在HCC中的生物学作用。由此阐明SIRT5在HCC发生发展过程中的作用,为进一步寻找肝癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的新的分子标志物及靶向治疗提供了理论依据。方法1、表达谱芯片技术筛选肝癌及癌旁组织中差异表达的mRNA通过mRNA基因芯片技术分析8对肝癌组织及其配对癌旁组织中mRNA的差异表达谱,使用独立样本的t-test,初步筛选出与肝癌早期复发、转移相关的潜在功能mRNA,然后通过qRT-PCR的方法在大样本量的早期复发、长期未复发肝癌,以及肝癌子灶及其配对组织中对随机挑选的mRNA表达水平进行检测,通过与芯片结果进行比对以对基因芯片的结果进行验证,最终筛选出在肝癌复发、转移中可能发挥作用的mRNA。2、SIRT5在肝细胞肝癌中的表达及意义采用免疫组织化学、荧光定量PCR和蛋白免疫抑制剂等实验方法检测并分析HCC组织、癌旁组织中SIRT5的表达水平。采用student's t-test分析SIRT5在肝癌}D织及癌旁组织中表达有无差异,Chi-square test检验和Spearman相关性分析其表达水平与临床病理特征以及患者预后之间的关系,以期能够初步了解SIRT5在HCC发生发展过程中可能发挥的作用。3、SIRT5对肝细胞肝癌生物学行为的影响首先利用qRT-PCR和Western blot方法检测SIRT5在HCC细胞株中的表达水平,筛选出SIRT5高表达的肝癌细胞株。在SIRT5高表达的肝癌细胞株中利用慢病毒干扰技术沉默SIRT5的表达,利用CCK-8、克隆形成、Transwell、等体外实验技术探明SIRT5对HCC细胞增殖、侵袭、迁移的影响。然后利用流式细胞技术、Western blot等技术检测SIRT5对HCC细胞周期和上皮间充质转化相关标志物的影响,以初步明确SIRT5在调控HCC细胞增殖、侵袭、迁移中的可能机制。4、SIRT5对肝细胞肝癌增殖、转移能力影响的体内研究利用上一部分构建的稳定沉默SIRT5的HCC细胞株,在裸鼠中皮下注射HCC细胞或经尾静脉注射HCC细胞,进而构建皮下种植瘤模型和血道转移模型。记录皮下成瘤小鼠的肿瘤体积,测量其肿瘤质量,并检测裸鼠皮下成瘤细胞周期蛋白表达水平;同时记录血道转移模型小鼠体重增长情况和肝脏肿瘤细胞转移病灶形成情况。最终在体内实验中进一步阐明SIRT5在HCC进展中的具体作用,以确定SIRT5在小鼠体内更为复杂的环境下的功能。结果1、mRNA在早期复发肝癌及肝癌子灶中的表达情况我们利用罗氏mRNA芯片检测4例早期复发(≤3个月)的新鲜HCC肿瘤及其配对(性别、年龄、分期)的4例无早期复发(≥2年)的HCC肿瘤组织;同时,也检测了 4对多病灶的原发HCC的子灶组织及其癌旁组织。通过聚类分析筛选出两组芯片结果中差异表达的mRNA。以升高、降低2倍为截断值,在早期复发的肝癌组织中,发现与无早期复发病例相比有2665个差异表达mRNA,同时另一组的子灶和癌旁组织相比发现有3065个差异表达mRNA,两组筛选结果取交集,获得特异性高表达/低表达的mRNA。从芯片所筛选出差异表达的m R N A中随机选取5个,进一步采用qRT-PCR的方法在20对肝癌组织及配对癌旁组织,以及20对早期复发、晚期复发的HCC组织中的表达水平,发现其表达水平在20对HCC子灶组织以及20对早期复发HCC组织中均明显升高,且qRT-PCR所检测的mRNA的表达水平排序与芯片结果基本一致,证明了基因芯片的可靠性。2、SIRT5在HCC组织中高表达并与预后相关我们首先利用qRT-PCR的方法在55对新鲜肝癌组织及其配对癌旁组织中检测SIRT5的表达情况,同时利用免疫组织化学技术(IHC)在166例HCC石蜡切片中检测SIRT5蛋白的表达情况。结果显示SIRT5 mRNA在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P=0.0015);IHC检测发现大部分HCC病例中SIRT5在肝癌组织中表达成明显的阳性,主要在细胞浆中,并根据IHC染色强度,分为完全阴性、阳性,以及强阳性。通过Spearman秩相关性分析发现SIRT5 mRNA表达与肝癌患者肿瘤直径(P = 0.019),肿瘤数目(P = 0.027),以及TNM分期肿瘤数目(P = 0.009)存在相关性,而与性别、年龄、病理分级、门脉癌栓、AFP、肝硬化、均无显著相关性;而SIRT5 IHC染色评分也与肝癌患者肿瘤直径(P = 0.009),肿瘤数目(P = 0.015),TNM分期(P = 0.007)存在相关性,而与性别、年龄、门脉癌栓、AFP、肝硬化、病理分级等均无显著相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析及log-rank检验结果发现SIRT5的表达水平与HCC患者总生存时间与无病生存时间存在相关性,SIRT5高表达提示预后不良。Cox比例风险回归模型证实SIRT5高表达是HCC患者预后不良的独立风险因素。3、体外实验证实沉默SIRT5抑制HCC细胞的增殖、侵袭、迁移能力慢病毒转染沉默HepG2和Huh7中SIRT5的表达后,发现HCC细胞的增殖、克隆形成和穿透Transwell小室的能力均显著下降。流式细胞技术检测发现SIRT5低表达导致HCC细胞发生G/S期阻滞,且qRT-PCR和Western blot检测发现促进细胞周期进展的周期蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6表达随SIRT5沉默而下降;此外,qRT-PCR和Western blot也发现SIRT5低表达后HCC细胞上皮表型标志物E-cadherin表达升高,而间充质表型标志物N-cadherin和Vimentin表达水平随之下降。4、动物实验证实沉默SIRT5导致HCC细胞体内增殖和转移能力下降与对照组相比,SIRT5沉默组小鼠皮下成瘤肿瘤生长速度明显减慢,体积明显减小。小鼠生长共3个月后统一处死,肿瘤称重,结果显示SIRT5沉默组肿瘤质量明显低于对照组。小鼠处死,肿瘤称重后抽提组织RNA与蛋白,通过PCR与WB检测细胞周期蛋白表达水平的改变。记过显示,与对照组相比,在沉默SIRT5的皮下成瘤组织中促进细胞周期进展的周期蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA与蛋白表达水平明显下降;同时沉默SIRT5的皮下成瘤组织中间质表型标志物N-cadherin与Vimentin的mRNA与蛋白表达水平明显下降,而上皮表型标志物E-cadherin表达水平相应升高。血道转移模型中,沉默SIRT5组小鼠基本未见肝转移,其中5只未发现肉眼可见肝转移病灶,而对照细胞组7只均发现肉眼可见肝转移病灶,两组肝转移病灶数目存在统计学差异。结论1、SIRT5在HCC组织中高表达,并且是HCC患者预后不良的独立风险因素,是预测肝癌患者预后的有价值的分子标志物。2、SIRT5可能通过促进细胞周期进展和上皮间充质转换促进HCC细胞的增殖、侵袭、迁移。3、动物实验证实SIRT5促进HCC肿瘤的增殖和转移。
【图文】：

肝癌,表达水平,芯片,基因芯片

以及２０对早期复发、晚期复发的ＨＣＣ组织中的表达水平，验证是否与芯片结逡逑果一致，结果显示其表达水平在ＨＣＣ子灶组织以早期复发ＨＣＣ组织中均明显升逡逑高（图１－２），且ｑＲＴ－ＰＣＲ所验证ｍＲＮＡ的表达水平排序与芯片结果基本一致（图逡逑１－３），证明了基因芯片的可靠性。逡逑表１－５随机挑选的５个验证用ｍＲＮＡｓ逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｒａｎｄｏｍｌｙ邋ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ｔｅｎ邋ｍＲＮＡｓ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ逡逑Ｎｏ．邋Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ逦Ｆｕｌｌ邋ｎａｍｅ逡逑１逦ＮＦＥ２逦１８逦Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｆａｃｔｏｒ，邋ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ邋２逦１逡逑２逦ＰＬＳ１逦１３１逦Ｐｌａｓｔｉｎ逦１逦４逡逑３逦ＣＸＣＬ１６逦２邋］邋９逦Ｃ－Ｘ－Ｃ逦ｍｏｔｉｆ邋ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ逦ｌｉｇａｎｄ邋１６逦５逡逑４逦ＢＡＴＦ逦３６．９逦ｂａｓｉｃ逦ｌｅｕｃｉｎｅ邋ｚｉｐｐｅｒ逦ＡＴＦ－ｌｉｋｅ逦３逡逑ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｆａｃｔｏｒ逡逑５逦ＭＥＴ逦２４逦ＭＥＴ逦ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ，，逦ｒｅｃｅｐｔｏｒ逦２逡逑逦ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｋｉｎａ

检测结果,芯片,肝癌

逦＊逡逑＇Ｊ＿＿：邋＾邋0￣邋0Ｊ＿＿；邋．．＾．邋■逡逑图１－２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ检测２０对早期复发肝癌（ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ邋ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，邋ＳＴＲ）及长期未复发肝癌组逡逑织（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ邋ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，ＬＴＲ），以及邋２０邋对肝癌肝内转移子灶（ｉｎｔｒｈｅｐａｔｉｃ邋ｍｅｔａｓｉａｓｉｓ，ＩＭ）逡逑和癌旁正常组织（ｐａｒａ－ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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