Neuralized1a调控小鼠Lewis肺癌干细胞的非对称分裂

发布时间：2020-02-25 00:26

【摘要】：目的从小鼠Lewis肺癌细胞中分离建立非对称分裂细胞系,鉴定其干性特征,并以此细胞系为模型,初步探讨非对称分裂在肿瘤干细胞中自我更新中的作用。方法(1)通过8次连续悬浮聚球,随后5次单细胞克隆的方法从小鼠Lewis肺癌细胞亲代细胞(Lewis Lung Carcinoma Parental cells,LLC-Parental cells)中得到非对称分裂细胞系(Lewis Lung Carcinoma Asymmetric Dividing cells,LLC-ASD cells)。(2)通过Brd U标记的免疫荧光实验检测验证LLC-ASD cells中细胞的非对称分裂。(3)进行RT-q PCR、克隆斑成斑实验、单细胞琼脂球形成实验、单细胞克隆形成实验对比两细胞系在体外培养中表现的干性特征。(4)通过同种小鼠肺部移植成瘤实验和裸鼠皮下成瘤实验分别对比两种细胞系在活体内的转移和成瘤能力。(5)通过RT-q PCR法筛选LLC-ASD cells中候选的非对称分裂基因。(6)设计合成目的基因对应的si RNA,转染LLC-ASD cells,通过RT-q PCR法和WB法验证si RNA对目的基因的干扰效果。(7)在转染后的LLC-ASD cells中通过Brd U标记的免疫荧光实验检测目的基因的干扰对非对称分裂的影响。(8)进行克隆斑成斑实验、单细胞琼脂球形成实验、单细胞克隆形成实验检测目的基因的干扰后的LLC-ASD cells在体外培养中表现的干性特征。(9)通过裸鼠皮下成瘤实验明确在LLC-ASD cells中目的基因的干扰与否对活体内成瘤能力的影响。结果(1)从LLC-Parental cells中得到LLC-ASD cells。(2)Brd U标记的免疫荧光实验证实LLC-ASD cells进行非对称分裂,且非对称分裂比率达50%。(3)LLC-ASD cells的克隆斑成斑情况(P0.001)、悬浮球形成数量(P0.05)、单细胞克隆形成率(P0.01)均分别高于LLC-Parental cells的。(4)LLC-ASD cells原位种植转移情况较LLC-Parental cells明显,LLC-ASD cells的裸鼠皮下接种致瘤能力也高于LLC-Parental cells(P0.05)。(5)筛选出了调控LLC-ASD cells非对称分裂的候选基因Neuralized1a。(6)以si RNA转染LLC-ASD cells,证实在RNA和蛋白水平上其对Neuralized1a的表达有良好的抑制效果。(7)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells中非对称分裂比率降低。(8)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells的克隆斑成斑情况(P0.001)、悬浮球形成数量(P0.001)、单细胞克隆形成率(P0.01)均分别低于对照组的。(9)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells的裸鼠皮下接种成瘤能力也低于对照组(P0.05)。结论成功建立了小鼠Lewis肺癌细胞非对称分裂细胞系,并且它表现出了一定干性特征,并以此细胞系为模型,证实Neuralized1a调控其非对称分裂。
【图文】：

=（长×宽×宽）/2。分析数±标准差（ x±s）表示，使用 Graphpad5.0 进行统计学用 t 检验。形态-Parental cells 基本全部贴壁增殖，异形性明显且排列紧密过程中偶尔有少量细胞悬浮增殖（图 1）。小鼠 LLC-ASD多呈梭形，，少部分圆形；所有梭形细胞与所有圆形细胞数

LLC-ASD 细胞的镜下生长形态（倒置显微镜下×100 拍摄）hology characteristic of LLC-ASD cells（×100 by inverted micro记法验证非对称分裂导航仪下随机选择视野观察拍照，计数结果显示 LLC-ASD率约为 50%（图 3）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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4 张

本文编号：2582581