调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究

发布时间：2020-03-09 08:10

【摘要】：血管在肿瘤的发展和转移过程中起着十分重要的作用,肿瘤细胞通过血管获得营养,同时血管也为肿瘤的转移提供通道。如果缺乏毛细血管,肿瘤的直径将被限制在1~2mm左右,从而容易发生坏死或凋亡。血管内皮生长因子(VEGF),又称血管通透因子,是最重要的血管生长刺激因子,它高度特异地与血管内皮细胞的受体结合,直接参与肿瘤血管的生成,从而促进肿瘤的生长和转移。迄今为止,VEGF家族陆续有7个成员被发现,即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子(PIGF)。其中,VEGF-A在血管生成中发挥最重要的功能,因此通常简称为VEGF。VEGF的表达调控主要发生在转录水平,因此通过转录因子对VEGF的转录进行调控是最主要的途径。VEGF启动子上包含很多个转录因子的结合位点,比如SP1、HIF-1、Stat3和AP1等,这些转录因子不仅可直接结合在VEGF的启动子上促进VEGF的转录,还可通过与生长因子、癌基因和抑癌基因的相互作用发挥调控VEGF的功能。除了目前已经报道的转录因子外,新的调控VEGF表达的转录因子的发现以及调控机制值得我们进行深入的研究。为了进一步获得新的可以调控VEGF表达的转录因子,我们将VEGF启动子上-2304 bp到+73 bp长度的片段克隆到荧光素酶表达载体,利用荧光素酶报告基因实验来筛选可以调控VEGF表达的转录因子。结果表明,在乳腺癌细胞ZR75-1内,通过对转录因子文库中的704个转录因子进行筛选,我们得到未曾报道的可以调控VEGF表达的转录因子GATA1和DEK,它们可以升高VEGF启动子报告基因的活性。因此,我们对GATA1和DEK在乳腺癌中调控VEGF表达的功能和机制进行了深入的研究。在乳腺癌细胞中,我们利用荧光素酶报告基因实验、荧光实时定量RT-PCR实验和ELISA实验得出,GATA1可以升高VEGF启动子荧光素酶报告基因的活性,上调VEGF mRNA和蛋白的表达水平,而敲低GATA1可以抑制VEGF启动子荧光素酶报告基因的活性,下调VEGF mRNA和蛋白的表达水平。在生物学功能方面,我们用细胞增殖实验、划痕实验和成管实验发现,高表达GATA1的乳腺癌细胞上调VEGF蛋白的分泌,进而促进血管内皮细胞HUVEC的增殖和迁移,在体外增强HUVEC细胞的成管能力,同时在鸡胚绒毛尿囊膜实验中,也可以促进新生血管的形成。相应的,在敲低GATA1的乳腺癌细胞中会得到相反的结果。在GATA1调控VEGF表达的分子机制方面,染色质免疫共沉淀实验和EMSA实验表明,GATA1结合在VEGF启动子转录起始位点的GATC序列处,而不是位于上游的GATA序列,并且可以募集组蛋白甲基转移酶SET7、RNA PolII和TFIIB到gatc序列处。set7可使h3k4发生单甲基化,通常激活基因的转录,我们的实验结果也证实,set7可与gata1协同促进vegf的转录。免疫共沉淀实验发现,gata1、set7、rnapolii和tfiib存在生理状态下的相互作用,它们可能形成一个转录起始复合物来调控vegf的转录。进一步的研究发现,gata1调控vegf的表达以及vegf介导的huvec细胞的增殖、迁移和血管形成都是通过set7来发挥作用。乳腺癌细胞的体外细胞增殖实验和体内裸鼠成瘤实验表明,gata1也是通过set7来调节乳腺癌细胞的生长和血管生成。对乳腺癌临床标本的分析表明,gata1和set7在乳腺癌中都是高表达的,均与vegf的表达和血管数量呈正相关。而且,通过对无病生存期(dfs)和总生存期(os)的分析,提示我们gata1和set7可能是乳腺癌的独立预后指标,说明gata1和set7在乳腺癌中的显著意义,为乳腺癌的治疗提供新的思路和策略。另一方面,我们利用荧光素酶报告基因实验、荧光实时定量rt-pcr实验和elisa实验发现,dek可以升高vegf启动子报告基因的活性,上调vegfmrna和蛋白的表达水平,而敲低dek可以抑制vegf启动子报告基因的活性,下调vegfmrna和蛋白的表达水平。在生物学功能方面,高表达dek的乳腺癌细胞上调vegf蛋白的分泌,进而可以促进血管内皮细胞huvec的增殖和迁移,在体外增强huvec细胞的成管能力,在鸡胚绒毛尿囊膜实验中也可以促进新生血管的形成。相应的,在敲低dek的乳腺癌细胞中会得到相反的结果。免疫共沉淀实验发现,缺氧诱导因子hif-1α(hypoxia-induciblefactor-1α)与dek相互作用。由于hif-1α在调控vegf中起着十分关键的作用,我们研究了hif-1α在dek调控vegf表达的过程中是否发挥功能。因此,我们将hif-1α敲低后进行了荧光素酶报告基因实验、荧光实时定量rt-pcr实验和elisa实验,结果表明,dek调控vegf的表达部分依赖于hif-1α。我们进一步对dek调控vegf表达的分子机制进行了研究,染色质免疫共沉淀的实验结果说明,dek直接结合在vegf启动子的dre序列处,同时通过与hif-1α相互作用间接地募集在hre序列处,而组蛋白乙酰转移酶p300在dre和hre处都有募集,并且dek可以影响hif-1α和p300在vegf启动子上的募集能力。免疫共沉淀实验发现,dek、hif-1α和p300存在生理状态下的相互作用,它们形成一个复合物来调控vegf的转录。利用乳腺癌细胞mda-mb-231进行的裸鼠成瘤实验表明,dek是以依赖和不依赖hif-1α两种途径来调控肿瘤的生长和血管形成。在临床意义上,对乳腺癌临床标本的分析显示,dek与vegf的表达和血管数量呈正相关。综上所述,我们发现新的可以调控vegf表达的转录因子gata1和dek,分别通过与SET7相互作用和部分依赖HIF-1α的调节机制来调控VEGF的表达和VEGF介导的HUVEC细胞的增殖、迁移和成管,以及调控乳腺癌细胞的生长和肿瘤血管生成,在乳腺癌的发生发展中起重要作用。
【图文】：

转录因子,转染,VEGF表达,统计学意义

调控VEGF表达的转录因子的筛选在ZR75-1细胞中转染VEGF-Luc和空载体或转录因子，24h后收取细胞进

MCF-7细胞,启动子,细胞,转染

图 1.1.1 敲低 GATA1 抑制 VEGF 启动子的活性在 ZR75-1 细胞、MCF-7 细胞和 MDA-MB-231 细胞中分别转染 VEGF-Luc和两条 GATA1 shRNA 或 control shRNA，48h 后收取细胞进行荧光素酶报告基因活性检测实验。Western blot 杂交实验检测 GATA1 的表达情况。图示数据是三次重复实验的平均值，与对照组相比，，*p < 0.05 表示有统计学意义。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3

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