微泡在CML疾病进展及停药监测中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-09 11:44

【摘要】：第一部分微泡在CML进展中作用的生物信息学研究及实验验证目的：微泡(MV)由母体细胞胞膜脱落,是一种新型的细胞间信息交流载体,含有母体细胞丰富的特征性内容物,同时能够将内容物传递至靶细胞全面改造受者细胞的生物学行为；我们前期的研究发现K562-MV中包含癌性酪氨酸激酶BCR-ABL1 mRNA以及大量癌性miRNA分子,能够通过传递BCR-ABL1及miRNA分子恶性转化正常造血细胞成瘤,与CML进展机制极为契合。本项目拟在前期研究的基础上,进一步明确K562-MV诱导正常造血细胞癌变的分子机制所在。方法：体外培养K562细胞,采用梯度离心法收集并鉴定MV,同时进行体外成瘤诱导实验；选取受转化不同时间点的受者细胞(0、7、14、21天),以及K562-MV,提取其RNA,进行表达谱及miRNA测序工作。测序结果采用生物信息学分析,获取诱导过程中具有显著性差异的基因及miRNA,根据转录因子谱及miRNA的靶点预测情况,构建诱导转化过程中发挥关键作用的前反馈环(FFL)。对于筛选出的miR-146b,采用荧光素酶实验荧光猝灭证明其靶基因为NUMB蛋白,转染miR-146b至K562-MV及K562细胞中,人为提升／降低MV中特定miR-146b的水平,观察对诱导转化过程的影响。在此基础上,2%琼脂糖电泳检测不同时间点靶细胞中DNA断裂情况；实时定量PCR和western blot检测诱导过程中不同时间点细胞内NUMB、MSI2、AICDA等分子的表达水平；ROS试剂盒检测诱导过程中不同时问点靶细胞内ROS水平的改变；同时,采用慢病毒体系转染NUMB蛋白至骨髓单个核细胞中,观察K562-MV对这部分转染NUMB的细胞的诱导效率如何,同时琼脂糖凝胶电泳观察DNA双链断裂情况。最后,收集临床CML患者标本,实时定量PCR检测其外周血MV中的miR-146b水平,并比较不同组间的差异。结果：通过精密质控,我们所留取的五个样本(K562-MV、d0、d7、d14、d21样本)RNA质量合格,成功的进行了表达谱测序及miRNA测序工作,并获取测序数据。我们分析了测序数据中在各个时间点具有显著性差异的基因及miRNA,根据功能将其归类,筛选出可能影响恶性转化过程的候选基因及miRNA分子；同时根据转录因子表达水平的波动,构建了多个以基因-转录因子-miRNA分子构成的前反馈环,从基因和miRNA的功能角度出发,探讨前反馈环在恶性转化中的可能的作用及机制。最终结果提示miR-146b是恶性转化过程中波动最大的miRNA分子,通过生物信息学预测,其可能结合NUMB mRNA调控其表达,而后者是影响CML疾病进展的重要分子,NUMB-STAT-miR-146b这一前反馈环可能是恶性转化的重要分子机制。根据生物信息学预测结果,我们通过转染的方式上调以及下调MV中miR-146b的水平,再以这部分MV诱导正常细胞,结果提示上调MV中的miR-146b后能够显著加速恶性转化进程：下调miR-146b则无明显影响。其机制是上调MV中的miR-146b后,受者细胞中的NUMB蛋白水平较前进一步下降,后者通过促进AICDA蛋白水平以及细胞内ROS水平,诱发细胞出现双链DNA断裂等基因组不稳定性成瘤。采用慢病毒转染NUMB至受者细胞中,人为提高其NUMB蛋白水平,再以普通K562-MV进行诱导,结果提示转化效率较前明显下降,双链DNA等基因组不稳定性同样下降。患者标本方面,我们的结果发现,慢性期患者外周血MV中的miR-146b水平显著低于急变期患者外周血MV中的水平。结论：我们在这部分研究中基于前期的测序结果,利用表达和调控网络分析,探索了K562-MV转化正常细胞为白血病样细胞这一体外诱导模型可能的转化机制；结果发现BCR-ABL1下游调控因子miR-146b通过靶向作用于NUMB这一CML疾病进展的关键蛋白,以及几个影响基因组不稳定和细胞增殖的重要基因促进转化。我们的工作对探索CML转化和供者细胞白血病意义重大,并为研究正常细胞向肿瘤样细胞转化提供了一个优秀模型。第二部分BCR-ABL1阳性微泡恶性转化正常造血细胞目的：CML是一种具有特征性的BCR-ABL1融合基因表达的骨髓增殖性肿瘤。目前TKI治疗CML已经成为经典的疾病治疗模式,患者长期无病生存率达90%以上。长期缓解患者能否安全的停用TKI类药物是最为引人关注的问题。但目前仍缺乏确切的证据指向哪一部分患者能够在停药后保持稳定的缓解状态,同时缺乏必要的动物模型及优秀的监测指标来指导停药工作。本部分拟从残留的白血病干细胞检测出发,分析其MV在停药研究中的监测作用及可能的生物学意义。方法：本研究纳入的停药病例来自武汉协和医院门诊及同济医院门诊,患者遵循自主知情同意原则参加本观察。我们首先回顾了2000年1月至2014年12月间1057名门诊确诊的慢性期、加速期及急变期CML患者,共22名慢性期及加速期患者在监测过程中停药。回顾性分析患者停药后复发的时间和疾病特征,比较停药后持续缓解组与复发组之间的特征差异；患者在停药前行骨髓细胞学穿刺,获取骨髓标本,停药后每月抽取外周血,实时定量PCR方法检测外周血细胞中及MV中BCR-ABL1 mRNA拷贝数改变。骨髓标本通过流式细胞仪检测慢性髓系白血病干细胞的数目和比例,同时检测骨髓中髓源抑制细胞的亚群和数目；比较停药后持续缓解组与复发组之间干细胞及髓源抑制性细胞的差异。将这部分骨髓尾静脉注入经亚致死量照射的NOD-SCID小鼠体内,定期称取小鼠体重,观察小鼠活动状态,于实验的第2周开始尾静脉采血,实时定量PCR检测人源性BCR-ABL1 mRNA水平；实验的第35天至第60天,处死小鼠,获取肝脏、脾脏、骨髓等组织,实时定量PCR检测上述组织中的BCR-ABL1水平,同时通过人源性抗CD45及抗CD38抗体进行免疫组化,观察上述组织中是否存在人源性细胞。体外以培养基及无MV的上清做对照,观察K562-MV对髓源抑制细胞的扩增作用。结果：我们的结果发现,10/22名患者在观察期内复发,分别于停药的1-14个月之间发生,其中早期复发(5个月之内)为6例。6例重新口服TKI并迅速获得分子学反应,4例患者拒绝继续服药,但仍未丧失主要分子学缓解,目前仍持续监测中。根据观察期内是否复发,我们将22名患者分为2部分进行比较,结果发现,停药后复发及TFR患者在TKI持续时间(70.5±7.7m vs.76.7±6.3m, P=0.54)。达到MMR时间(10.3±1.6 vs.7.5±1.4,P=0.21)以及年龄(29.2±4.3 vs.36.4±6.2,P=0.34)等方面均没有显著性差异。骨髓流式细胞学检测发现：22例中有20例患者骨髓中能检测到CD34+CD38-CD26+细胞即慢性髓系白血病干细胞。然而在停药后缓解组和复发组患者之间,CD34+CD38-CD26+细胞数缺乏显著性差异(0.27%±0.07 vs 0.24%±0.07,P0.05)。将这部分骨髓植入小鼠体内后,44例小鼠中有9例出现明显的倦怠、竖毛、活动减少和体重下降,在9例注射患者骨髓单个核细胞的小鼠中有6例出现脾大(图4C),符合慢性粒细胞白血病的疾病特征。通过人的抗CD45和抗CD38的免疫组化鉴定,在小鼠的骨髓、肝脾肾中存在一种表达人源性CD45、CD38的类白血病细胞的恶性细胞。在停药后分子学复发组的7例患者骨髓,有5例使小鼠出现了白血病(No.3,4,11,12,17导致7只小鼠成瘤)症状；而在TFR组,只有2例患者的骨髓使小鼠出现了白血病症状,提示小鼠模型能够部分预测患者停药后是否复发。此外,我们发现患者骨髓中CD14+HLA-DRLow、CD14+HLA-DRLow/-、CD14+HLA-DR-、 CD11b+CD3/14/16/19/20/56-、CD33+HLA-DR-CD14/56-等五群MDSC组分在停药后复发组均明显升高(P0.05),而K562-MV能够显著扩增MDSC。监测方面,我们发现与细胞中一致,MV中的BCR-ABL1 mRNA水平随患者的治疗反应不同而改变。我们将完全分子学缓解的患者分为2组,服用TK1组和接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)组。有趣的是,在allo-HSCT组MV内的P210水平明显低于接受TKI组(2.10±0.24 vs 0.72±0.15,P0.05)。在22例停用TKI病人中,后期复发患者的MV内BCR-ABL1拷贝数明显较TFR组高。结论：本部分研究首次报道中国CML患者停药数据,同时我们探索了CML-LSC与停药后复发之间的关系。病人停药后是否复发取决于LSC功能而不是数目,尤其是分泌MV以及通过MV扩增MDSC的相关能力。小鼠异种移植模型结果与停药后患者复发结果部分重叠,为研究LSC作用和预测复发提供了一个新颖、实用的选择。MV检测可能增加LSC检测的敏感性,为TKI停药患者制定合适的分子学检测方案提供重要提示。
【图文】：

图１．五个测序样本中所有基因、ｍｉＲＮＡ表达差异及各样本间重叠情况

基因,转化过程,显著性差异,趋势

ＴuQ（３、Ｗｎｔ、和ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ通路有等量的上调、下调基因。逡逑根据转化过程中各阶段表达变化将ＤＥＧｓ和ＯＥＭｓ分成８组：ＤＤＤ、ＤＤＵ、ＤＵＤ、逡逑ＤＵＵ、ＵＤＤ、ＵＤＵ、ＵＵＤ和ＵＵＵ（Ｄ：下调，Ｕ：上调）（图２）。在转化过程中有７０２逡逑个基因持续表达增加（ＵＵＵ组），主要在＂翻译起始＂和》细胞周期过程＂富集（补充表逡逑Ｓ５）。４０６个持续下调的基因（ＤＤＤ）主要富集于Ｕ免疫应答，对刺激应答＂和＂产生细逡逑胞因子＂通路。根据转化过程第３期表达变化（上调或下调），将该８组ｍｉＲＮＡ分成逡逑２组（图２Ａ和Ｂ）。第３期中许多上调的ｍｉＲＮＡｓ均被报道为痛性ｍｉＲＮＡｓ如逡逑ｍｉ民－１７／１８ａ／２０ａ／９２ａ／３７８ａ／１３０ｂ，它们可能促进细胞增殖和迁移。相反，，转化过程中许逡逑多抑癌邋ｍｉ民ＮＡｓ邋或调亡相关邋ｍｉＲＮＡｓ，如邋ｍｎｉ－１５／１６＾８１ａ／３０ｄ／３０ｅ／％ａ／１４２－３ｐ邋（ＵＤＤ邋组）逡逑均下调。ＤＤＤ组几乎全部ｍｉＲＮＡｓ，包括ｍｉＲ－１４８ａ／ｌｅｔ－７／１９９ａｂ／３０ｅ被报道有抑制肿瘤逡逑或促调亡的功能，这与转化过程中的发现一致。逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7

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