肿瘤细胞来源的exosome在肝癌免疫治疗中的功能研究

发布时间：2020-03-11 22:08

【摘要】：肝细胞肝癌恶性度高,进展迅速,预后差,每年约有60万新发病例,为临床的治疗带来了极大挑战。近些年来,免疫治疗受到较大关注,其中树突状细胞(DC)介导的免疫治疗已在一些肿瘤治疗如黑色素瘤、非小细胞肺癌、泌尿系肿瘤、脑胶质瘤等取得较大进展。然而,由于肝脏特殊的免疫生物学特点,肝癌的免疫治疗进展并不顺利。以肝癌细胞裂解物为抗原,以DCs为瘤苗的免疫治疗在肝癌异位小鼠模型的研究取得了较好效果,然而,进一步的II期临床试验在肝细胞肝癌患者体内引起的抗肿瘤免疫应答有限。近年来对肿瘤细胞来源的exosome(TEX)的研究发现,TEX携带肿瘤相关抗原,可作为一些肿瘤免疫治疗的天然抗原来源。进一步研究显示,在肾癌和髓性白血病模型上,相较细胞裂解物,TEX作为抗原,可引起更强的免疫应答,取得更好的肿瘤抑制效果。然而,在肝癌方面尚缺乏研究。本研究尝试以肝癌细胞来源的exosome作为抗原,活化DCs作为瘤苗,通过观察肝癌小鼠异位及原位模型的肿瘤变化,检测小鼠系统免疫应答及肝癌免疫微环境来评价TEX的抗肝癌免疫效果,并进一步研究体外对人肝癌细胞的杀伤作用。通过与肝癌细胞裂解物的比较,为肝癌免疫治疗提供更好抗原选择,取得更好抑瘤效果。目的:1.评估多种常用的建立肝癌小鼠模型的方法,获得成瘤效率高、稳定性强、均一性好的肝癌小鼠模型,并探索荷瘤小鼠肝癌免疫微环境的特点。2.探索TEX作为抗原在体外杀伤肿瘤效果。3.探索TEX的体内抑瘤效果,肝癌免疫微环境的变化。4.研究TEX的作用机制并测试对人肝癌的免疫功能。方法:1.通过尾静脉注射、脾内细胞注射、肝内细胞注射、肝内组织移植等多种方法,建立小鼠肝癌模型,比较不同方法的成瘤时间、成瘤率,病理特点、转移率等。通过流式和ELISA检测小鼠外周血免疫细胞和免疫因子的变化,通过免疫组化染色检测肝癌内部免疫细胞的浸润。2.电镜、nanosight、免疫印迹实验等多种方法鉴定肝癌细胞上清中提取的exosome的形态、大小、纯度及特征性蛋白质的表达,通过荧光染色研究DC对exosome的摄取,通过流式细胞仪检测DC细胞表型的变化,应用CFSE染色和免疫因子分泌检测T细胞的活化,通过乳酸脱氢酶检测活化的T细胞对肝癌细胞的细胞毒作用。3.测量肝癌异位及原位小鼠模型的肿瘤长径及短径,计算肿瘤体积、记录各组小鼠生存期,从外周血和肿瘤内分离荷瘤小鼠免疫细胞及血清,通过酶联免疫吸附实验检测荷瘤小鼠外周血免疫活化与抑制性因子的表达,流式分析外周血及肝癌内部CD4+及CD8+T细胞。同时提取人源肝癌细胞来源exosome,外周血分离培养人DC及淋巴细胞,检测其活化T细胞能力及对人肝癌细胞的细胞毒作用。4.通过荧光染色追踪DC,并通过对免疫缺陷鼠的治疗判断T细胞在免疫活化中的作用。结果:1.与肝内和脾内细胞接种获得的多结节、分散分布,大小不一的模型相比,肝内组织接种建立的肝癌模型单结节、均一性好,适于本课题研究。肿瘤内可见T淋巴细胞明显浸润,和临床肝癌患者的情况相近。2.肝癌细胞来源的exosome表达AFP、GPC3等肿瘤相关抗原及肿瘤伴侣蛋白HSP70,且AFP在TEX上富集。TEX作为抗原能被DC摄取,促使DC细胞成熟,显著增强其活化T细胞的能力。活化的T细胞表现出强大的肿瘤杀伤能力。3.TEX作为抗原能有效抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期,改善肿瘤免疫微环境。TEX在体内的免疫活化是T细胞依赖性的。相对于细胞裂解物,TEX能引起更强的抗肝癌免疫应答。4.TEX能有效杀伤人肝癌细胞。结论:1.肝内组织接种法建立的原位肝癌模型能反映临床上肝癌的病理学和免疫学特点,是一种理想的建立移植型肝癌原位模型的方式。2.TEX是肝癌免疫治疗的有效抗原载体,能在体内外引起强烈抗肿瘤免疫应答,有望成为肝癌免疫治疗的重要抗原来源。
【图文】：

核质比增加（图1 F）。坏死组织中可见大量炎症细胞浸润（图 1G）。以上说明 Hepa1-6 细胞在C57BL/6 成瘤率高，肿瘤生长迅速，病理学特点明显。肝内组织移植一般选择在皮下瘤瘤径长至 1cm 左右时进行，统计发现，四组长径至 1cm 所需时间分别为2.88±0.63 周、2.00±0.71 周、1.75±0.29 周、1.50±0.41 周（表一），可根据需要选择细胞种植数量，在合适时机剥除肿瘤用于原位瘤组织接种。

152：细胞尾静脉注射建立原位肝癌模型。A：尾静脉注射肿瘤分布。从左为肺、心脏、肝和肋骨。可以看到肺上布满肿瘤结节，心脏也被侵犯明显肉眼可见结节，，虚线圈住部分为肋骨肿瘤结节。B：尾静脉注射 染色。从上至下分别为肺、肝和心脏的 HE 染色。右侧图片为左侧框中放大图，可见肺和心脏的肿瘤浸润，肝脏无肿瘤结节。图中标尺均为 10
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：2586370