去乙酰化酶SIRT3在非小细胞肺癌恶性进展中的作用及其机制的初步研究

发布时间：2020-03-28 09:30

【摘要】：背景:肺癌是世界范围内致死率首位的癌症,而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数的80-85%,其有效治疗对提升人类健康水平意义重大。传统的手术治疗和放化疗则由于适应性、耐药和毒副作用在治疗中捉襟见肘。近年来,基于驱动基因的靶向治疗在NSCLC中大放异彩,然而耐药和不敏感问题依然存在,因此NSCLC的恶性机制需要继续深入研究。蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰在生命活动中广泛存在且作用关键。NAD依赖的去乙酰化酶沉默信息调节因子3(NAD-dependent deacetylase sirtuin-3,SIRT3)是机体内重要的去乙酰化酶,通过去乙酰化作用调控重要蛋白的功能,广泛调节细胞生命进程,影响多种疾病的发展转归。由于NSCLC的遗传异质性以及SIRT3底物广泛性等复杂影响因素,SIRT3在NSCLC中的作用存在争议,相应的分子机制有待阐明。因此,探索SIRT3对NSCLC的作用及相应分子机制将对理解NSCLC的恶性进展规律乃至治疗提供新的理论依据。目的:探索SIRT3对NSCLC恶性进展的作用以及相应分子机制。方法:(1)收集70对NSCLC肿瘤组织及相应正常组织标本和临床信息。采用免疫组化、蛋白印迹及实时定量PCR技术探索SIRT3在NSCLC临床组织和正常组织中mRNA水平和蛋白表达水平的差异;(2)采用免疫组化定量统计方法分析SIRT3和NSCLC临床病理特征的关系以及SIRT3和NSCLC增殖指标Ki-67表达、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)活化的关系;(3)采用RNA干涉技术和质粒过表达技术建立SIRT3低表达和过表达NSCLC细胞系(H520:SIRT3-;SW900:SIRT3-;H520:SIRT3+),利用蛋白印迹技术检测SIRT3含量对Akt磷酸化水平的影响,采用激光共聚焦技术、蛋白免疫共沉淀技术探索SIRT3和Akt的相互作用关系;(4)采用免疫组化技术探索磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、SIRT3、p53在NSCLC组织中的相关性;采用蛋白印迹技术探索PTEN和SIRT3在NSCLC细胞系中蛋白表达状况,根据结果采用RNA干涉技术和质粒过表达技术建立不同PTEN表达背景下,SIRT3高低表达的细胞模型(H520:PTEN-/SIRT3-、PTEN+/SIRT3-;A549:PTEN-/SIRT3+、PTEN+/SIRT3+);(5)在上述细胞模型中,采用蛋白印迹技术和蛋白免疫共沉淀技术探索不同PTEN表达背景下,SIRT3对p53含量的影响,以及借助泛素蛋白酶体途径相关抑制剂探索SIRT3对p53泛素化降解路径的调控作用;(6)利用激光共聚焦技术、蛋白免疫共沉淀技术探索SIRT3和p53的相互作用关系,并利用上述细胞模型,探索PTEN缺失背景下,SIRT3对p53的去乙酰化修饰作用。结果:(1)SIRT3在NSCLC临床组织中较正常组织显著高表达;(2)SIRT3和病人预后相关,高表达SIRT3病人生存期较短;SIRT3表达和NSCLC的病理分型有关,其中鳞癌表达较高;SIRT3和其余病理特征无明显关联;(3)在NSCLC组织中,SIRT3和恶性增殖指标Ki-67、p-Akt(磷酸化活化的Akt)呈现正相关;在NSCLC细胞系中,SIRT3可以与Akt共定位和共沉淀;在NSCLC细胞系中SIRT3可以促进Akt的磷酸化活化;(4)在NSCLC组织中,PTEN呈现低表达,在此背景下,呈现出SIRT3的高表达和p53的相应低表达。在PTEN缺失的NSCLC细胞系中,SIRT3可以促进泛素蛋白酶体介导的p53降解,而在PTEN存在的情况下,却失去这种作用;(5)在PTEN缺失的NSCLC细胞系中,SIRT3可以去乙酰化p53的赖氨酸320/382位点,这种翻译后修饰可能和p53的稳定相关。结论:(1)SIRT3在NSCLC组织中高表达,且和恶性增殖指标Ki-67正相关,同时SIRT3的高表达也预示着相对较差的预后,这些线索提示SIRT3可能在NSCLC扮演着癌基因的作用;SIRT3的表达量与NSCLC的病理分型相关,但是NSCLC分期分化等恶性程度特征没有明显关联,这可能归因于肿瘤的异质性和个体遗传背景的差异性以及SIRT3作用底物的广泛性。这些均提示SIRT3在NSCLC中的机制复杂多样;(2)p-Akt是促进肿瘤恶性进展的中心枢纽,Akt的去乙酰化可以显著影响其磷酸化活化,而SIRT3是细胞内重要的去乙酰化酶,这些线索提示SIRT3可能通过去乙酰化修饰促进Akt的磷酸化活化,进而促进NSCLC的恶性进程。本课题发现在NSCLC组织中SIRT3和p-Akt正相关,同时在NSCLC细胞系中,SIRT3能够促进Akt的磷酸化活化;并且SIRT3可以和Akt发生共沉淀和共定位,这些结果部分作证了SIRT3通过调节Akt影响NSCLC的科学假说;(3)p53的去乙酰化修饰抑制了其抑癌功能,而PTEN的去乙酰化修饰则促进其肿瘤抑制功能,这些提示在不同遗传背景的肿瘤中,去乙酰化修饰会发挥不同的作用。本课题中,在NSCLC组织中,PTEN呈现低表达,而SIRT3高表达,同时p53低表达,这提示在特定PTEN缺失背景下的NSCLC中,SIRT3可能通过抑制p53含量来发挥自身的癌基因作用;同时,我们在NSCLC模型中进一步揭示了在PTEN缺失的背景下,SIRT3可以促进泛素蛋白酶体介导的p53的降解;进一步研究发现,SIRT3可以去乙酰化p53的赖氨酸320/382位点,而相应位点的去乙酰化修饰则抑制了p53功能。因此这些结果提示了SIRT3在PTEN缺失背景下,通过对p53的调节影响NSCLC的恶性进展。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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本文编号：2604262