融合蛋白tTF-EG3287对人结直肠癌裸鼠移植瘤血管的靶向栓塞作用

发布时间：2020-03-29 01:34

【摘要】：研究背景和目的:当前临床上应用于抗肿瘤的栓塞剂存在适应症狭窄、载药量小、成本高、介入途径困难等问题,我们计划设计一种新的多肽,即利用某一单克隆抗体的药物靶向性,加载促凝因子,有针对性性地、高效地诱发肿瘤血管血栓形成。基于这一研究思路,我们成功构建了融合蛋白tTF-EG3287的重组基因,EG3287是由外显子7和8编码的双环多肽,tTF是截短组织因子,具有激活外源性凝血反应;融合蛋白tTF-EG3287发挥抗肿瘤作用必须首先由载体分子EG3287准确定位到肿瘤血管内皮细胞,效应分子tTF诱发肿瘤血管血栓形成,导致肿瘤细胞缺血坏死,从而达到治疗目的。实验方法:重组质粒tTF-EG3287的构建及转化等步骤已在前期实验基础上完成。LB平板挑选高表达菌株后,过夜培养,然后以1∶100比例扩大培养,生长至对数期添加诱导剂IPTG,继续培养6-8h;统一收菌,由12%SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色对不同的蛋白表达量进行验证及比较;不断优化IPTG的诱导浓度及时间。超声破菌后,包涵体复合物经多次洗涤、离心再反复搅拌溶解后过镍柱纯化。蛋白复性在含梯度尿素的PBS系统中透析完成。免疫荧光共聚焦法和血栓弹力图检测法检测蛋白活性。构建结直肠癌移植瘤模型后,随机分组,每组5只,分别为Saline组(PBS),tTF-EG3287治疗组和tTF治疗组,蛋白经荷瘤裸鼠尾静脉注射间断给药,每次给药前测瘤体积。Cy5.5标记融合蛋白tTF-EG3287和tTF,经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内后,活体成像观察药物的生物学分布,24h后处死裸鼠,解剖分离瘤体和各组织器官,继续成像;病理切片HE染色,评价药物的靶向栓塞作用。实验结果:本实验纯化浓缩得到的融合蛋白tTF-EG3287浓度达2.1mg/mL,纯度85%,体外促凝活性及细胞靶向结合作用明显;在结肠癌荷瘤裸鼠实验中,连续治疗27d后,tTF-EG3287与tTF治疗组裸鼠移植瘤平均体积均小于Saline对照组,与对照组相比,tTF治疗组差异无显著差异,而tTF-EG3287治疗组差异有统计学意义(n=5,P0.01),tTF-EG3287的荷瘤裸鼠TGI(抑瘤率)为79.2%(n=5,P0.01),tTF的TGI为48.5%(n=5,P0.05);活体成像实验中,tTF-EG3287能在荷瘤裸鼠体内靶向富集于肿瘤组织,在除肺外的其他正常组织器官富集很少,而tTF无特定靶向性;24h后器官成像显示tTF-EG3287能稳定、持久地靶向富集于肿瘤组织,而tTF在各脏器及肿瘤内几乎无富集;病理切片HE染色显示tTF-EG3287治疗组肿瘤血管内有混合血栓形成,而tTF治疗组的各器官未见明显缺血坏死灶,表现基本正常。结论:本实验优化了包涵体目的蛋白的纯化及活性鉴定等步骤;融合蛋白tTFEG3287生物学作用稳定,在结直肠癌裸鼠移植瘤体内,能准确分布于癌组织,靶向栓塞肿瘤血管,抑制肿瘤细胞的生长。
【图文】：

高效表达,冻存,诱导表达,菌株

图 1-1 tTF-EG3287 高效表达菌株的筛选Screening of bacteria colonies with highly expression yields of tTF:Marker;2:Induced without IPTG;3-12:Induced by 0.5mmol/L IPT 1-1 所示，，2-12 号管在约 35.0 KDa 处不同程度地表达 tTF-EG 的阴性对照和 3-12 管相同浓度 IPTG 诱导表达的目的蛋白诱异，但仍有少量表达，这可能与 IPTG 的作用浓度和时间有关优表达菌株，用细菌冻存液-20 ℃留种保存。 IPTG 诱导浓度

浓度,冻存,高效表达,诱导表达

图 1-1 tTF-EG3287 高效表达菌株的筛选 Screening of bacteria colonies with highly expression yields of tTF1:Marker;2:Induced without IPTG;3-12:Induced by 0.5mmol/L IPTG 1-1 所示，2-12 号管在约 35.0 KDa 处不同程度地表达 tTF-ETG 的阴性对照和 3-12 管相同浓度 IPTG 诱导表达的目的蛋白诱异，但仍有少量表达，这可能与 IPTG 的作用浓度和时间有关优表达菌株，用细菌冻存液-20 ℃留种保存。 IPTG 诱导浓度
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】