CSN5通过稳定ZEB1介导肾癌细胞转移及EMT的机制研究

发布时间：2020-03-29 20:52

【摘要】：研究背景和目的:肾细胞癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的2-3%,近几年其发病率还在逐年升高,死亡率达到40%左右~([1,2])。当前能够治愈肾细胞癌的方法只有行根治性手术~([3-5]),但是很多患者就诊时已经为晚期,不能行手术治疗。即使对于早期患者,根治性手术切除后约25%仍有复发转移的风险;而传统的放化疗对肾癌效果不佳~([6]),因此使得晚期肾癌患者没有很好的治疗方法,预后较差。肾癌的分子标记物相比于其它肿瘤较少~([7])。因此研究肾癌转移侵袭的发生机制,发现新的靶点及治疗手段迫在眉睫。CSN是一种多亚基蛋白复合体,通过调控泛素蛋白酶体的降解过程而参与肿瘤的发生发展,CSN5是CSN第5个亚单位,又是其活化中心~([8,9])。CSN5参与了各种细胞活动的调控,如细胞的增殖及凋亡~([10,11])。许多证据表明CSN5与人体多种恶性肿瘤相关~([12,13])。阻断CSN5可以达到抗肿瘤治疗的效果~([14])。而在多种恶性肿瘤~([15-17])中,CSN5表达水平越高,则预后会更差。然而肾癌中CSN5的表达形式及生物学行为目前尚不清楚。EMT是上皮细胞到间皮细胞的转变,与肿瘤细胞转移侵袭关系密切,是恶性肿瘤获得浸润能力的重要方式,在多种恶性肿瘤中呈高表达~([35,36])。ZEB1是EMT过程中的一个重要转录因子,ZEB1引起的EMT参与了多种肿瘤的过程~([42-44])。ZEB1是通过泛素化系统降解的~([50]),有研究报道有泛素化连接酶会驱动肾细胞癌的EMT,并通过上调ZEB1表达来增加肾细胞癌的侵袭能力~([46])。CSN5是通过对泛素化连接酶进行脱泛素化参与肿瘤的发展~([61,62]),因此我们推测CSN5是否也是通过ZEB1介导肿瘤转移侵袭及EMT的。为了证明我们的推测,首先我们检测了所收集临床肾癌患者标本组织中CSN5的表达水平,分析CSN5的表达与肾癌患者的临床特点及生存率的关系;其次通过体内外实验探讨CSN5与ZEB1的关系及其对肾癌细胞转移侵袭能力及EMT的影响;最后研究CSN5调控ZEB1的具体机制。方法:1、应用qRT-PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学方法检测手术切除后的肾癌组织、相对应癌旁组织中CSN5 mRNA和蛋白的表达水平,收集患者的临床病理特征资料,统计CSN5的表达与患者的临床病理特征、生存率之间的关系;2、将ACHN、786-O、A498和caki-1四种肾癌细胞株和正常人肾细胞株HK中CSN5的表达进行检测;稳定转染shCSN5到ACHN肾癌细胞中,运用Western blot及qRT-PCR检测肾癌细胞中CSN5蛋白和mRNA的表达变化;降低肾癌细胞中CSN5的表达,应用Transwell实验观察肾癌细胞转移侵袭能力的变化;比较转染和未转染shCSN5的肾癌细胞株的裸鼠皮下肿瘤大小和肺转移发生率;3、用Western-blot和免疫荧光实验比较在肾癌细胞中沉默CSN5后EMT标志蛋白表达的变化;用荧光定量PCR和Western-blot检测使CSN5表达升高或降低后ZEB1的表达变化;用Transwell实验检测沉默CSN5后的肾癌细胞转染ZEB1质粒的转移侵袭能力;Western-blot检测所收集的40例肾癌组织及癌旁组织中CSN5与ZEB1的相关性;4、利用免疫共沉淀及免疫荧光方法证实CSN5是直接作用于ZEB1,western blot及免疫共沉淀实验证明CSN5调控ZEB1的表达是通过泛素化系统来实现的。结果:1、qRT-PCR和Western blot显示40例样本中肾癌组织中CSN5的mRNA和蛋白表达水平均高于癌旁正常组织(p0.05);免疫组化实验显示80例患者中,肾癌组织中有45例CSN5为高表达,阳性率为56.3%,癌旁组织有21例高表达,阳性率为26.3%;而且CSN5的阳性表达差异与肿瘤的T分期、肿瘤的大小有关;CSN5的阳性表达与肾癌患者生存率呈负相关。2、将shCSN5转染到肾癌ACHN细胞中,qRT-PCR和western blot显示沉默CSN5后其mRNA和蛋白表达水平均降低(p0.05);Transwell实验显示沉默CSN5的肾癌细胞转移侵袭能力降低;动物实验发现转染shCSN5组较转染空质粒组,y|鼠皮下形成的肿瘤更小(p0.05),肺转移发生率更低。3、用Western blot和免疫荧光实验发现CSN5高表达后波形蛋白和N-钙粘蛋白表达升高,而E-钙粘蛋白表达下降;CSN5高表达后ZEB1表达也增加,相反CSN5表达下降后ZEB1表达也下降;而ZEB1 mRNA水平并不会受CSN5调节异常而变化。沉默CSN5后显著降低了ACHN细胞的转移及侵袭能力,而由CSN5沉默引起的转移和侵袭能力的下降,可以通过上调ZEB1来增加。4、免疫共沉淀和免疫荧光证实在肾癌细胞中内源性CSN5与ZEB1是结合在一起的,免疫共沉淀和Western blot结果证实CSN5稳定ZEB1蛋白水平是通过泛素蛋白酶体系统(UPS)实现的。结论:CSN5在肾癌中表达升高,能调控肾癌细胞的转移侵袭能力及EMT,它的机制是通过泛素蛋白酶体系统稳定ZEB1蛋白水平。
【图文】：

统计学方法,统计学意义,检验方法,标准误

5. 统计学方法所有实验数据均以平均值土标准误(X 土 SEM)表示，计数资料以百分比或示，统计学方法采用 t 检验、ANOVE 以及 Fisher 检验方法，使用 SPSS1计软件对数据进行分析，若 P<0.05 则为差异有统计学意义，P<0.01 为差异著统计学意义。结果1．检测 CSN5 在肾癌组织及癌旁组织中的表达(1)从所采集的肾癌组织及癌旁组织标本中随机选取 40 例，应用 qRT-P测 CSN5 mRNA 的表达情况。qRT-PCR 结果显示 CSN5 mRNA 的表达在肾织中明显高于癌旁正常组织（p<0.01）。如图 1.1

曲线绘制,泛素化,肾癌,亚基

n-Meier 曲线绘制肾癌组织中 CSN5 的低表达和高表p＜0.01。讨论种多亚基蛋白复合体，CSN5是CSN的第5个被人认知[8,9]。CSN 具有识别泛素化底物的作量的研究显示 CSN5 能够通过泛素化参与调从而参与了各种细胞的增殖与凋亡过程[10,11]，素化系统降解的，近来也有越来越多的研究证生进展过程[15-17]。例如，阻断 CSN5 的表达，SN5 高表达往往伴随着不良愈后[16]，文献报的发生与转移密切相关。那么，CSN5 是否也 CSN5 在肾癌中的表达情况以及其与患者临
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11

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