基于肝细胞外基质构建体外三维乳腺癌细胞模型研究肿瘤的耐药机制

发布时间：2020-03-30 08:15

【摘要】：目的:构建基于肝细胞外基质(Liver Biomatrix,LBM)与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养的三维体外乳腺癌模型;研究LBM对不同培养条件下乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和对化疗药物敏感性的影响;探索LBM与肿瘤细胞粘附以及肿瘤干细胞干性维持介导肿瘤耐药的机制。方法:采用脱氧胆酸钠(SDC)灌流法获取SD大鼠LBM,采用液滴重叠法与MDA-MB-231细胞共培养构建LBM三维乳腺癌细胞球体外培养模型。采用alamar blue法检测乳腺癌MDA-MB-231细胞在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培养条件下的增殖情况,以及对常用化疗药物紫杉醇(PTX)、多西他赛(DTX)、表柔比星(EPI)、顺铂(DDP)、氟尿嘧啶(5-Fu)、环磷酰胺(CTX)、吉西他滨(GEM)、长春瑞滨(NVB)、依托泊苷(VP-16)的敏感性。使用流式细胞仪检测在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培养条件下MDA-MB-231细胞内EPI含量的阳性细胞率和中位荧光强度,荧光显微镜观察细胞内EPI的荧光强度。用RT-PCR方法分别检测乳腺癌细胞在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培养条件下,耐药基因(Bcl-2、MRP2、MRP3、MDR1)、凋亡基因(Bax、Caspase-3)、细胞膜表面LBM受体基因(67KDLR、ITGB1)、粘附耐药信号通路基因(FAK、AKT、FOXO3、NF-κβ、Survivin)、以及肿瘤干细胞干性维持信号通路基因(LEF-1、FN1、SNAIL1/2、SOX9、TGF-β)的表达情况,对比不同培养条件下的基因表达差异。结果:1、SD大鼠肝脏经脱细胞后,经HE染色和免疫组化染色显示肝脏细胞成份脱失,获取肝脏细胞外基质(LBM)成份。MDA-MB-231细胞与LBM共培养构建三维肿瘤细胞球体外培养模型,在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM条件下培养,第4天时的增值活力分别为第1天的6.8、8.4、1.4和2.1倍。MDA-MB-231细胞的3D和3D+LBM肿瘤细胞球经石蜡切片HE染色,细胞均呈现类圆形,3D+LBM培养的细胞球更为致密。2、研究常用化疗药物对乳腺癌细胞MDA-MB-231的敏感性,检测其IC20值(μg/m L),紫杉类化疗药PTX、DTX作用于2D+LBM细胞的IC20值(0.87、1.5)低于2D(1.3、2.1),其余化疗药物(EPI、DDP、5-Fu、CTX、GEM、NVB、VP-16)的在2D+LBM条件下IC20值均高于2D;在3D+LBM条件下所有化疗药物均明显高于2D+LBM。检测MDA-MB-231细胞对EPI的内吞与外排,内吞10min、30min和60min,2D+LBM细胞的EPI阳性细胞率(27%、36%和68%)低于2D(46%、62%和85%),3D(45%、61%和84%)与2D相似,3D+LBM(25%、32%和43%)最低。2D+LBM的EPI中位荧光强度(716、942和1438)低于2D(1091、1356和1807),3D(891、1108和1692)与2D相似,3D+LBM(479、281和462)最低,表明3D+LBM时细胞内吞EPI量最低,且随着作用时间的延长,EPI荧光强度越强。EPI外排时间为0h、1h、2h和4h时,2D+LBM的EPI阳性细胞率(45%、26%、20%和17%)低于2D(65%、55%、39%和36%),3D(63%、45%、21%和19%)与2D相似,3D+LBM(43%、23%、16%和13%)最低;检测细胞在不同培养条件下、不同外排时间时细胞中EPI中位荧光强度,2D+LBM(986、733、630和618)低于2D(1252、1117、922和869),3D(1022、914、496和468)低于2D,3D+LBM(806、599、494和467)最低,结果提示,3D+LBM时细胞外排的EPI量最多,随着外排时间延长,EPI的荧光强度越弱。3、使用RT-PCR检测和对比乳腺癌耐药相关基因的表达情况,加入LBM共培养后,无论2D或3D培养条件下,耐药基因Bcl-2、MRP2、MDR1表达上调,凋亡基因Bax、Caspase-3较2D表达下调;粘附耐药信号通路基因FAK、AKT、FOXO3、NF-κβ、Survivin表达上调;在2D培养条件下加入LBM时,细胞膜表面LBM受体基因(67KDLR和ITGB1)表达上调;肿瘤干细胞干性维持通路基因LEF-1、FN1、SOX9、TGF-β表达上调。结论:1、SD大鼠LBM与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养可以形成3D肿瘤细胞球,LBM可以促进MDA-MB-231细胞的增殖,且3D培养较2D培养增殖速率慢。2、对于化疗药物的抗肿瘤活性测试发现,3D培养条件下对化疗药物的IC20明显高于2D培养;相较于2D、2D+LBM与3D培养,3D+LBM培养时的肿瘤细胞表现出更高的化疗药物耐受性。LBM可以促进MDA-MB-231细胞对EPI的内吞减少,外排增加。3、LBM和MDA-MB-231细胞共培养时可以促进粘附受体基因和耐药基因的表达,抑制凋亡基因表达,促进粘附耐药相关信号通路基因和肿瘤干细胞干性维持相关通路基因的表达。本研究提示MDA-MB-231细胞与LBM共培养体外三维模型更符合体内生长环境,LBM促进MDA-MB-231细胞产生耐药,研究耐药机制可能和粘着斑激酶FAK-AKT通路中的(FAK、FOXO3、NF-κβ、Survivin)有关,并和TGF-β信号通路中的(LEF-1、FN1、SOX9、TGF-β)相关。
【图文】：

图 1 SD 大鼠脱细胞前后大体照片（A）。SD 大鼠肝脏和脱细胞外基质 DAPI 染（B）。SD 大鼠肝脏脱细胞外基质（LBM）DNA 含量、GAGs 及胶原检测（CSD 大鼠肝脏及脱细胞外基质 HE 染色、免疫组化染色（D）。Figure 1 General photo (A) before and after decellularization in SD rats. SD rat liverand acellular extracellular matrix (LBM) DAPI stained nucleus (B). Detection of DN22

SD 大鼠肝脏脱细胞后，肝脏细胞成分脱去，脏面由暗红色变A)。将 SD 大鼠肝脏和 LBM 进行 DAPI 染核，发现经脱细留，见图 1(B)。通过检测 DNA、GAGs 及胶原含量，进行 残留较少，为脱细胞前 SD 大鼠肝脏的 6%，GAGs 及胶原保留，分别为未脱细胞肝脏的 21%和 83%，见图 1(C)。 进行 HE 染色和免疫组化染色，也可发现 LBM 相较脱细胞，肝脏脉管系统和肝脏细胞外基质成份得到保留，硫酸乙HS）、层连蛋白（Laminin，LN）、纤连蛋白（Fibronectinen，Nid）、I 型胶原（Collagen I，C1）、III 型胶原（CollagCollagen IV，C4）、V 型胶原（Collagen V，，C5）、VI 型胶脱细胞前后均无明显差异，见图 1(D)。+LBM 培养乳腺癌细胞球的形态表征
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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本文编号：2607290