HER2特异性CART细胞的制备及其对胃癌抑制作用的体外和体内研究

发布时间：2020-03-30 11:21

【摘要】：研究背景胃癌是世界最常见恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,尤其是晚期胃癌患者,目前仍缺乏有效治疗手段可以显著提高生存时间。近年来,以放化疗为主的传统疗法因复发率高、不良反应严重等缺点而屡遭诟病,随着生物学技术发展,具有肿瘤特异性杀伤效果的靶向治疗逐渐成为国际研究热点。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR) T细胞免疫治疗属于细胞靶向治疗方式之一,即通过病毒等载体将可识别特定抗原的CAR基因转染并表达于T细胞,体外扩增后回输入患者体内引起特异性抗肿瘤免疫反应。CAR分子主要由胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区四部分组成。为增强CART细胞增殖活化能力,研究者不断增加信号传导区内共刺激分子的数量,发展出新一代CART细胞,大大提高了 T细胞抗肿瘤能力。该疗法具有高特异性和非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性等优点,并在血液恶性肿瘤的治疗中获得显著的临床效果,然而其在实体瘤的临床应用中受到很大挑战,主要包括严重不良事件的发生,肿瘤免疫抑制微环境,CAR-T细胞归巢能力和局部活化能力差等问题。人表皮生长因子受体 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)蛋白在胃癌患者中过表达,同时研究证明其对肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)亚群的生存和功能维持起到重要的作用。鉴于曲妥珠单抗在胃癌治疗中的显著效果,表面抗原HER2可作为CAR T细胞治疗的较理想靶点。研究目的在这项研究中,我们以HER2scFv-CD8-CD137-CD3i;质粒为基础,构建了一种新颖的HER2特异性CAR分子,经慢病毒转染后,观察CAR基因修饰T细胞的表型特征,并评估C A R T细胞对胃癌细胞和胃癌干样细胞的体内和体外杀伤能力。研究方法1、通过慢病毒载体将CAR受体的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因转染入T细胞,并利用流式细胞仪检测CAR T细胞转染效率和表型特征。2、体外培养胃癌细胞,利用流式细胞仪检测HER2表达情况,并通过慢病毒介导的短发卡RNA (shRNA)基因沉默技术敲低胃癌细胞HER2表达。3、细胞因子ELISA法检测CART-HER2细胞在体外对胃癌细胞的特异性活化能力,LDH释放实验检测CART-HER2细胞在体外对胃癌细胞的特异性杀伤能力。4、培养原代胃癌细胞,利用肿瘤细胞成球实验获得胃癌干样细胞,并通过CART细胞与胃癌细胞球共培养实验评估CART细胞对胃癌干样细胞的杀伤能力。5、利用HER2阳性胃癌细胞和胃癌干样细胞建立BALB/C裸鼠胃癌模型。6、通过测量小鼠移植瘤的体积和重量评估CART细胞体内胃癌肿瘤抑制能力。7、通过小鼠外周血和肿瘤内C A R基因拷贝量检测和病理组织免疫组化染色评估C A R T细胞的体内持续和归巢能力。研究结果1、成功将CAR受体的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因转染入T细胞,转染效率为 34.22% 士 4.00%,体外扩增后,CAR T细胞 CD8+CD56-表型比例为 72.55% ± 7.26%,中央记忆表型 CD45RO+CD62L+CCR7+比例为 23.35% ±7.59%。2、胃癌细胞系HER2阳性率为84.39%～98.60%,两株原代胃癌细胞HER阳性率分别为 56.80%和 2.48%,N87-HER2KD 细胞和 7901-HER2KD 细胞 HER2 阳性率分别为 41.01%和 56.00%。3、CART-HER2细胞与HER2阳性胃癌细胞共培养后,释放的白介素2、干扰素-γ、白介素4、粒细胞巨噬细胞刺激因子、肿瘤坏死因子、颗粒酶B等细胞因子水平显著高于对照组,对肿瘤细胞的杀伤效率也明显优于对照组。4、成功培养出胃癌干细胞球,HER2和CD44阳性率分别为73.5%和98.6%。CART细胞与胃癌干细胞球共培养48小时后,肿瘤球被分解成小片,大量肿瘤干样细胞死亡裂解,杀伤效果显著高于对照组。5、通过皮下注射HER2阳性胃癌细胞或胃癌干样细胞成功建立胃癌BALB/C裸鼠模型。6、CART-HER2细胞治疗组小鼠肿瘤生长速率明显受到抑制,肿瘤平均体积和平均质量显著低于NT T细胞治疗组。7、治疗3周后,小鼠外周血和肿瘤内CAR基因平均拷贝量处于高水平状态,而至少56天内,小鼠外周血CAR基因拷贝量处于可检测水平。免疫组化染色提示大量人CD3阳性T细胞浸润肿瘤组织,明显高于对照组。结论1、携带HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因的慢病毒成功合成,病毒转染T细胞后,CAR蛋白能够稳定表达于T细胞表面。2、CART-HER2细胞经体外培养后,细胞大量增殖,其中绝大部分细胞为CD8+效应T细胞,同时中央记忆型T细胞比例也明显提高。3、CART-HER2细胞在体外能够被HER2阳性胃癌细胞特异性激活,分泌大量细胞因子,并能有效地裂解多种HER2阳性的胃癌细胞以及胃癌患者来源的原代细胞。4、CART-HER2细胞可以有效、持续、靶向定位地抑制HER2阳性胃癌BALB/c裸鼠模型的生长。5、CART-HER2细胞在体外能够明显抑制HER2阳性胃癌干细胞球的生长,并能有效识别并裂解患者来源的HER2阳性胃癌干样细胞。6、HER2阳性胃癌干样细胞可以在BALB/c裸鼠皮下成瘤,而CART-HER2细胞有效抑制了移植瘤在裸鼠体内的生长。
【图文】：

示意图,体外培养,人外周血单核细胞,系统合成

一）人外周血单核细胞的分离、病毒转染、体外扩增以及表型鉴定逡逑我们已在以前的研究中成功构建了含ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＣＤ邋１３７－ＣＤ３Ｇ基因的粒（图１），本实验使用临床级复制缺陷性慢病毒三质粒系统合成病毒颗粒，时构建了含ＧＦＰ基因的表达质粒来验证转染效率，以及不含ｓｃＦｖ的表达质ｏｃｋ对照。逡逑ＨＥＲ２特异性ｓｃＦｖ逦信号域逡逑里逦皇逡逑ＶＬ邋￣Ｕ￣邋ＶＨ逦ＣＤ８ａ邋ｈｉｎｇｅ邋ａｎｄ邋ＴＭ邋ＣＤ１３７邋ＣＤ３Ｌｉｎｋｅｒ逡逑图邋１：邋ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＣＤ１３７－ＣＤ３；邋ＣＡＲ邋基因序列示意图逡逑１00ｎ逦ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２逡逑

志愿者,细胞表型,细胞,特征对

主要为邋ＣＤ８＋ＣＤ５６－细胞（７２．５５％邋±７．２６％），而中央记忆（ｃｅｎｔｒａｌ邋ｍｅｍｏｒｙ邋Ｔ，Ｔｃｍ）逡逑表型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋邋Ｔ细胞比例约为２３．３５％邋±邋７．５９％，显著高于ＮＴ邋Ｔ细胞逡逑（图３和图５）。ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２邋Ｔ细胞和Ｍｏｃｋ邋Ｔ细胞的平均转染效率分别为３４．２２％邋士逡逑４．００％和３２．９５％邋±４．７６％邋（图４）。我们选择来源于其中一名志愿者的生长状态最佳的逡逑细胞组开展后续功能实验。逡逑１００逦＿邋ＣＡＲ丁－ＨＥＲ２逡逑■ｉ邋ＮＴ逡逑ｉｍ逡逑＾逦＾逦，邋NB逡逑ｃ／邋ｃ／邋ｃ／逡逑图３：来源于３名志愿者的ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２细胞和ＮＴＴ细胞表型特征对比逡逑７５－，逡逑ｂ邋６０－逡逑爸４５－逡逑Ｉ邋３０－逦—＝Ｊ＝—逡逑§邋１５－逡逑ｈ１逡逑０－１逦１逦１逦逡逑ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２邋ｃｅｌｌｓ邋Ｍｏｃｋ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑图４：来源于３名志愿者的ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２细胞或ＭｏｃｋＴ细胞平均转染效率对比逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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